上海源葉生物科技有限公司作者
(一)熒光測(cè)量靈敏度
靈敏度的高低是衡量?jī)x器檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo),一般以能檢測(cè)到單個(gè)微球上zui少標(biāo)有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)或藻紅蛋白(phyloerythrin,PE)熒光分子數(shù)目來(lái)表示,現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到600個(gè)熒光分子。
(二)分辨率
分辨率的高低是衡量?jī)x器檢測(cè)量精度的指標(biāo),通常用變異系數(shù)(CV)值來(lái)表示:
CV=D/M×l00%(其中D是分布的標(biāo)準(zhǔn)差,M是分布的平均值)
如果一群含量*相等的樣本用FCM來(lái)測(cè)量,理想的情況下,CV為0;用FCM測(cè)量曲線表示為垂直于橫軸的直線。但是在整個(gè)系統(tǒng)檢測(cè)中會(huì)帶人許多誤差,其中樣本含量本身的誤差、樣本在流進(jìn)照射光區(qū)域的微量變化、再加上儀器本身的誤差等,實(shí)際得到的是一呈正態(tài)分布的曲線,CV值越小則曲線分布越窄越集中,測(cè)量誤差就越小,一般的FCM在*狀態(tài)時(shí)CV值均<2%。CV值除了采用以上的計(jì)算公式外,還可用半高峰寬來(lái)計(jì)算,半高峰寬指在峰高一半的地方量得的峰寬,它與CV值有以下的關(guān)系:
CV=半高峰寬/M×0.4236X100%
上述公式建立在正態(tài)分布的條件下,而實(shí)際數(shù)據(jù)分布常常是非對(duì)稱圖形,故采用半高峰寬所計(jì)算得到的CV值要明顯小于統(tǒng)計(jì)公式得到的CV值,在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)引起注
意。
(三)前向角散射光檢測(cè)靈敏度
靈敏度是指能夠檢測(cè)到的zui小顆粒大小,目前FCM可以測(cè)量到0.2—0.5mm。
(四)FCM的分析速度
分析速度是以每秒可分析的細(xì)胞數(shù)來(lái)表示,當(dāng)細(xì)胞流過(guò)光束的速度超過(guò)FCM儀器響應(yīng)速度時(shí),細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)就會(huì)被丟失,這段時(shí)間稱為儀器的死時(shí)間。死時(shí)間越短,則儀器的處理速度越快,一般可達(dá)3 000~6 000/s,大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
(五)FCM分選指標(biāo)
分選指標(biāo)包括分選速度、分選純度及分選收獲率。分選速度指每秒可提取的細(xì)胞數(shù)。目前臺(tái)式帶分選儀器的分選速度約為300/s;大型機(jī)約為每秒上萬(wàn)個(gè)。分選純度指被分選出細(xì)胞所占的百分比,目前大型機(jī)與小型機(jī)分選純度均可達(dá)到99%。分選收獲率指被分選出的細(xì)胞與原來(lái)溶液中該細(xì)胞的百分比。通常情況下,分選純度和收獲率是互相矛盾的,純度高,收獲率下降,反之亦然。這是由于樣本在流液中并不是等距離一個(gè)接一個(gè)有序地排列,而是隨機(jī)的。一旦兩個(gè)不同細(xì)胞相距得很近時(shí),在強(qiáng)調(diào)純度和收獲率不同條件下,儀器會(huì)作出取舍的決定。因此,選擇不同模式要視具體實(shí)驗(yàn)要求而定。
流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍 自20世紀(jì)70年代以來(lái),隨著流式細(xì)胞技術(shù)水平的不斷提高,其應(yīng)用范圍也日益廣泛。流式細(xì)胞術(shù)已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
目前國(guó)內(nèi)外FCM在醫(yī)學(xué)臨床及科研中的應(yīng)用主要有以下幾方面:①監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫狀態(tài);②組織配型與監(jiān)控移植的排斥反應(yīng);③白血病的診斷及療效觀察;④遺傳性血小板疾病的診斷;⑤細(xì)胞DNA定量及細(xì)胞周期的分析;⑥細(xì)胞凋亡的檢測(cè);⑦細(xì)胞特異性標(biāo)志物的測(cè)定;⑧細(xì)菌的鑒定。
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