方法簡(jiǎn)介
所謂的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 就是通過對(duì)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。
RT-qPCR是由三個(gè)步驟組成:
1.反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;
2. 擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;
3.檢測(cè):實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.
RT-qRCR影響分析可靠性關(guān)鍵點(diǎn)（Key porint）:
1.分析結(jié)果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測(cè)方法設(shè)計(jì)
2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的非標(biāo)準(zhǔn)化影響試驗(yàn)的穩(wěn)定性
3.數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結(jié)果中會(huì)得到混淆的錯(cuò)誤結(jié)果，因此通過對(duì)RT-qPCR的每一組分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)以達(dá)到zui小化變異性，zui大化可重復(fù)性，而且還需要沿用一個(gè)通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對(duì)基因表達(dá)分析的標(biāo)準(zhǔn)化的需要是與人類臨床診斷分析相適應(yīng)的。