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線粒體H+- ATP酶試劑盒,微板法

線粒體H+- ATP酶試劑盒,微板法

] 本試劑盒僅供科研使用 1 線粒體 H+ - ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS3680W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 線粒體是細(xì)胞呼吸代謝的重要場(chǎng)所，位于線粒體內(nèi)膜的 H+ -ATP 酶是氧化磷酸化偶 聯(lián)的關(guān)鍵組分。H+ -ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和無(wú)機(jī)磷，本試劑盒通過(guò)測(cè)定無(wú) 機(jī)磷的量來(lái)確定該酶活性高低。 二、試劑盒的組成和配制： 【注】：全程操作需無(wú)磷環(huán)境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避 免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、線粒體 H+ -ATP 酶活性檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免 實(shí)驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、線粒體制備（提示：整個(gè)線粒體的提取過(guò)程須保持 4℃低溫環(huán)境）： ① 稱(chēng)取約 0.2g 組織或收集 1000 萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞，加入 1mL 提取液 1，用冰浴勻漿器或研 缽冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管后于 4℃×3000g 離心 20min。 ② 小心吸取上清液（棄沉淀）移至另一離心管中，4℃×16000g 離心 20min。用移液器 移除上清液（上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 H+- ATP 酶（此步可選做））。留下沉淀（沉淀即為線粒體）。 ③ 在沉淀（線粒體）中加入 200μL 提取液 2，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 5s，間隔 3s，重復(fù) 30 次），液體置于冰上用于線粒體 H+- ATP 酶活性測(cè)定。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取，或按 照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 740nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 1 提取液 60mL×1 瓶 4℃保存 提取液 2 提取液 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 17mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 2.5mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑三 液體 3mL×1 支 4℃保存 試劑四 粉劑×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 2.5mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑五 粉劑×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 0.7mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑六 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑七 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 1.5mL×1 瓶 4℃保存 臨用前加 1.2 mL 的 B 液，再加 15.47 mL 的蒸餾水，混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 EP 管中依 次加入： ④ 顯色反應(yīng)（在 96 孔板中操作）： 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 1.1664x-0.0002，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0002)÷1.1664×V2] ÷（V1×Cpr）÷T =19.93×(△A+0.0002)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 定義：每小時(shí)每克組織分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(W× V1÷V)÷T =19.93×(△A+0.0002)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.04×(△A+0.0002) 5、液體中酶活力計(jì)算: 定義：每小時(shí)每毫升液體分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力（μmol/h/mL）=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷V1÷T=19.93×(△A+0.0002) 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 140 150 試劑二 20 20 試劑三 30 30 試劑四 20 20 樣本 40 40 混勻，靜置 5min 試劑五 10 混勻，37℃孵育 20min 試劑六 50 50 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測(cè) 上清液 100 100 試劑七 150 150 混勻，室溫靜置 15min，740nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。本試劑盒僅供科研使用 3 V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.04mL ； V2---酶促反應(yīng)總體積，0.31mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1/3 小時(shí)； W---樣本鮮重，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 10mL 蒸餾水溶解。（母液需在兩天內(nèi)用）。 2 把母液稀釋成九個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根據(jù)實(shí) 際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。