亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-232029
分光光度法 50管/24樣
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
亞硝酸還原酶（NiR）試劑盒測定意義
硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或 NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。
亞硝酸還原酶（NiR）試劑盒測定原理
亞硝酸還原酶可將 NO2—還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO2—減少，即 540nm 處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、、研缽、可見分光光度計、水浴鍋、低溫離心機、1mL 玻璃比色皿。
的組成和配制
提取液：液體 80mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑 1 瓶，4℃保存。 臨用前加 12mL 蒸餾水溶解。
試劑三：液體12ml×1 瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）。
試劑四：液體25ml×1 瓶，4℃避光保存。 （如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）。
試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。
工作液：臨用前，根據(jù)用量將試劑四 和試劑五 按 1:1 的比例混合。
酶液提取
- 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
- 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。
- 注意：空白管只需測定一次。
- 計算公式
標準曲線：y = 1.3594x +0.0072，R2 = 0.9997
x為標準品濃度（μmol/mL）y為吸光值（A 標準管-A 空白管）
1．按照蛋白含量計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/mg prot）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 反總÷（V 樣×Cpr） ÷T= 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義：每克組織每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.0072]÷1.3594×V 標÷（W×V 樣÷V樣總）÷T=1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.0072）÷W
- 按照細胞數(shù)量計算
酶活單位定義：每 104 個細胞每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/104 cell）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.0072÷1.3594×V 反總÷（細胞數(shù)量 ×V 樣÷V 樣總）÷T= 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.0072）÷ 細胞數(shù)量
V 標：標準液體積，0.2mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g
亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒注意事項
- 配制好的試劑三、試劑四 3 天內(nèi)使用完。
- 若吸光值超過3，將上清液進行適當?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)
- 嚴格控制顯色時間，否則會對結(jié)果有影響。
- 標準曲線線性范圍為0.03umol/mL-1.5umol/mL。
- A空白管-（A測定管-A對照管）線性范圍為0.02-3
注：電子試劑盒說明書僅供參考、具體請參考試劑盒紙質(zhì)版說明書。
環(huán)保在線