脂多糖( LPS )，也稱為內毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。LPS是脊椎動物先天免疫系統(tǒng)的強力刺激劑，可引起發(fā)燒、感染性休克、死亡。它也被認為是檢測細菌病原體入侵的生物標志物，負責炎癥反應和內毒素休克的發(fā)展。在生物材料，如蛋白質、多肽或抗體樣品中檢測LPS是生物制造和生物加工的一項重要任務。Portelite 快速熒光法內毒素檢測試劑盒使用Endotoxin Green，一種敏感的熒光底物。Endotoxin Green可以在內毒素和鱟血細胞提取物鱟素( LAL )的存在下水解，產生強烈的綠色熒光。內毒素活性與Endotoxin Green水解產生的熒光強度成正比。Portelite 快速熒光法內毒素檢測試劑盒針對Cytocite™和Qubit™熒光儀進行了優(yōu)化，可以檢測樣品中廣泛存在的內毒素(從1 EU / ml到0.002 EU / ml)。
適用儀器
| CytoCite熒光計 | |
| Ex: | 480nm |
| Em： | 510-580nm |
| 耗材推薦: | 0.2 mL, 薄壁PCR管 |
樣品分析方案
概述
制備細胞裂解液（LAL）工作溶液
添加大腸桿菌內毒素標準品和測試樣品（50µL）
添加LAL工作溶液（50µL）
在37°C下孵育30分鐘
準備并添加Endotoxin Green工作溶液（100µL）
用CytoCite監(jiān)測熒光
溶液配制
儲備溶液配制
1.Endotoxin Green儲備液
對于試劑盒#60008，將50µL DMSO加入一小瓶Endotoxin Green中 （組分A）制備內毒素底物儲備溶液。對于試劑盒#60009，將500µL DMSO加入一小瓶Endotoxin Green中 （組分A）制備內毒素底物儲備溶液。 注意避光。
2.LAL細胞裂解液儲備液
對于試劑盒#60008，將500µL無內毒素水（組分B）添加到LAL試劑瓶（組分C）中，制成5倍LAL儲備溶液。對于試劑盒#60009，將2.5 mL無內毒素水（組分B）添加到LAL試劑瓶（組分C）中，制成5倍LAL儲備溶液。
標準溶液配制
E、 大腸桿菌內毒素標準溶液
將10µL 100 EU/mL大腸桿菌內毒素標準溶液添加到990µL無內毒素水（組分B）中，生成1 EU/mL的大腸桿菌內毒素溶液。然后取1 EU/mL大腸桿菌內毒素標準溶液，在無內毒素水（組分B）中進行1:3的連續(xù)稀釋，以獲得連續(xù)稀釋的大腸桿菌內毒素1至0.001 EU/mL。
工作溶液配制
1. Endotoxin Green工作溶液
對于試劑盒#60008，添加50µLEndotoxin Green 將儲備溶液溶于5mL無內毒素水（組分B）中，使總體積為5.05mL Endotoxin Green工作溶液。對于試劑盒#60009，添加500µLEndotoxin Green 將儲備溶液溶于50mL無內毒素水（組分B）中，使總體積為50.5mLEndotoxin Green工作溶液。 注：每次測試需要100µL，請將工作溶液避光，將未使用的儲備溶液儲存在-20°C。
2. LAL工作溶液
對于試劑盒#60008，將500µL LAL細胞裂解液儲備溶液添加到2 mL無內毒素水（組分B）中，使總體積為2.5 mL LAL細胞裂解液（LAL）工作溶液。對于試劑盒#60009，將2.5 mL LAL細胞裂解液（LAL）儲備溶液添加到10 mL無內毒素水（組分B）中，使總體積為12.5 mL LAL裂解液工作溶液。
操作步驟
1.在0.2 mL PCR管（Cat#CCT100）中制備大腸桿菌內毒素標準品、空白對照品或測試樣品（50µL）。
2.向每管大腸桿菌內毒素標準品、空白對照品和測試樣品中加入50µL鱟紅細胞裂解液工作溶液。
3.充分混合并在37°C下孵育30分鐘。
4.添加100µLEndotoxin Green 每管內毒素標準品、空白對照品和測試樣品的工作溶液，使總分析體積為200µL/孔。
5.將樣本放入CytoCite 并用綠色熒光通道監(jiān)測熒光。
注：為獲得良好結果，在添加工作溶液后2至10分鐘內讀取。
注：可加入50µL 25%乙酸以停止反應。
