脂多糖( LPS )，也稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。LPS是脊椎動物先天免疫系統(tǒng)的強力刺激劑，可引起發(fā)燒、感染性休克和死亡。它也被認(rèn)為是檢測細(xì)菌病原體入侵的生物標(biāo)志物，負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)和內(nèi)毒素休克的發(fā)展。在生物材料，如蛋白質(zhì)、多肽或抗體樣品中檢測LPS是生物制造和生物加工的一項重要任務(wù)。Amplite 熒光法內(nèi)毒素檢測試劑盒使用Endotoxin Green，一種敏感的熒光底物。Endotoxin Green在內(nèi)毒素和鱟血細(xì)胞提取物( LAL )的存在下水解。Endotoxin Green的水解產(chǎn)物產(chǎn)生強烈的綠色熒光。內(nèi)毒素活性與Endotoxin Green水解產(chǎn)生的熒光強度成正比。Amplite 熒光法內(nèi)毒素檢測試劑盒可檢測廣泛的內(nèi)毒素(從1 EU / ml到0.001 EU / ml)。它是非常敏感的，可以在30分鐘內(nèi)檢測到低至0.001 EU / mL的內(nèi)毒素。
適用儀器
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| Ex: | 490nm |
| Em： | 525nm |
| Cutoff: | 515nm |
| 推薦孔板: | 純黑色孔板 |
| 讀取模式： | 底讀 |
樣品分析方案
概述
制備Endotoxin Green工作溶液
添加大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品（25µL）
添加鱟溶血酶溶液（25µL）
在37°C下孵育30分鐘
準(zhǔn)備并添加Endotoxin Green工作溶液（50µL）
在10分鐘內(nèi)讀取Ex/Em=490/525 nm時的熒光強度
溶液配制
儲備溶液配制
1.Endotoxin Green儲備液
將50µL DMSO添加到Endotoxin Green小瓶中（成分A）制成100X Endotoxin Green儲備溶液。
2. 5X LAL細(xì)胞裂解液儲備液
將500µL無內(nèi)毒素水（組分B）加入鱟細(xì)胞裂解液（組分C）小瓶中，制成5X鱟細(xì)胞溶解液溶液。
E、 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液
將10µL 100 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到990µL無內(nèi)毒素水（組分B）中，生成1 EU/mL的大腸桿菌內(nèi)毒素溶液（ES1）。然后取1 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（ES1），在無內(nèi)毒素水（B組分）中進行1:3的連續(xù)稀釋，得到連續(xù)稀釋的大腸桿菌內(nèi)毒素（ES2-ES7）。
工作溶液配制
1. Endotoxin Green工作溶液
添加50µLEndotoxin Green將儲備溶液溶于5mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為5.05mL Endotoxin Green工作溶液。
2. LAL工作溶液
將500µL鱟細(xì)胞裂解液（LAL）儲備溶液添加到2 mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為2.5 mL鱟細(xì)胞溶解液（LAL）工作溶液。
注：根據(jù)需要和使用前準(zhǔn)備LAL工作溶液的量。使用無內(nèi)毒素瓶或試管。
操作步驟
表1.大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品在透明底部96孔微孔板中的布局。ES=E。大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（ES1-ES7，1.00至0.001 EU/mL）；BL=空白對照；TS=試樣
| BL | BL | TS | TS |
| ES1 | ES1 | ... | ... |
| ES2 | ES2 | ... | ... |
| ES3 | ES3 | ||
| ES4 | ES4 | ||
| ES5 | ES5 | ||
| ES6 | ES6 | ||
| ES7 | ES7 |
表2.每個孔的試劑組成
| 孔 | 溶液體積 | 使用試劑 |
| ES1-ES7 | 25ul | 連續(xù)稀釋（1至0.001 EU/mL） |
| BL | 25ul | 無內(nèi)毒素水 |
| TS | 25ul | 測試樣品 |
1.根據(jù)表1和表2中提供的布局，制備大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（ES）、空白對照品（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每個孔使用12.5µL試劑，而不是25µL。
2.向大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對照品和測試樣品的每個孔中加入25µL 2X鱟鱟裂解液。
3.充分混合并在37°C下孵育30分鐘。
4.添加50µL Endotoxin Green將工作溶液添加到大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對照品和測試樣品的每個孔中，使總分析體積為100µL/孔。對于384孔板，添加25µL Amplite Endotoxin Green將工作溶液注入每個孔，總體積為50µL/孔。
5.檢測Ex/Em=490/525nm，Cutoff:515nm的熒光強度。
注：為獲得良好結(jié)果，在添加工作溶液后2至10分鐘內(nèi)讀取。 注：可加入25µL 25%乙酸以停止反應(yīng)。
