目的

1．了解稀釋法分離土壤微生物的原理。

2．學(xué)習(xí)并掌握由土壤分離細(xì)菌和真菌的方法。

3，掌握有目的分離有益微生物的原理和技術(shù)。

原理

土壤是微生物棲居的大本營(yíng)，各種各樣的微生物都雜居在一起。當(dāng)我們需要某種微生物時(shí)，即可通過提供適宜的營(yíng)養(yǎng)條件，或添加只利于所需菌生長(zhǎng)而抑制其它菌生長(zhǎng)的抑制劑，有選擇地將所需菌分離出來，這種技術(shù)即稱為微生物的分離與純化。稀釋法常用于分離土壤、各種水域及基物表面的微生物。其原理是：先將土壤樣品進(jìn)行一系列倍比稀釋，然后將幾個(gè)適當(dāng)濃度的稀釋液均勻涂布于分離培養(yǎng)基表面。經(jīng)培養(yǎng)后，土壤中的單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子即可在培養(yǎng)基表面形成肉眼可見的菌落。再將所需菌落轉(zhuǎn)入試管斜面,然后經(jīng)平板劃線再次取得單菌落后，即可得到所需菌種的純菌株。因此，本方法的zui大特點(diǎn)是可以對(duì)土壤樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)，如果采用選擇性培養(yǎng)基，可以分離到目的菌株。其全過程見圖24-1。

本方法分離土壤微生物具有一定的局限性，首先，由于采用平板培養(yǎng)，厭氧的微生物不宜在平板上生長(zhǎng)，如果需要分離厭氧微生物，還需要厭氧操作裝置。其次，采用的幾種培養(yǎng)基不一定能適于土壤中所有的微生物生長(zhǎng)，特別是那些目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物。本實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)菌、放線菌和真菌的zui適培養(yǎng)基，對(duì)各大類微生物進(jìn)行分離和活菌計(jì)數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)還針對(duì)可以產(chǎn)生纖維素酶的微生物而設(shè)計(jì)了選擇性分離培養(yǎng)基。分別根據(jù)分離目的設(shè)計(jì)出相應(yīng)的篩選模型。制備含有不同底物的培養(yǎng)基平板，將稀釋的土壤懸液涂布，或?qū)⒎蛛x到的菌株直接點(diǎn)接在選擇性平板表面，置適宜溫度培養(yǎng)后，可通過肉眼觀察來判斷目的需要的目的菌株。

材料

1．樣品：過篩（孔徑約2mm）的新鮮土壤樣品（使用前先測(cè)定含水量）。

2．培養(yǎng)基：在300ml 三角瓶中分別分裝150ml 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和高氏1 號(hào)培養(yǎng)基。

3．選擇性培養(yǎng)基：纖維素酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)基 （選做）

4．滅菌物品：250ml 三角瓶分裝90ml 無菌水（內(nèi)含20-30 粒玻璃珠），18×180mm 試管分裝9ml 無菌水，培養(yǎng)皿，1ml 吸管，玻璃刮鏟。

方法

1．制備土壤稀釋液：用小天平稱分別稱取少時(shí)潮濕的菜園土和風(fēng)干的菜園土各10g，置于90ml 含玻璃珠的無菌水中，震蕩10min，靜置30 秒后，即得土壤原液（10－1）。再用1ml 無菌吸管吸取1ml 上清液加到9ml 無菌水中，充分搖勻，即得（10－2）稀釋液。依次類推，潮濕土制得10－1 至10－6 稀釋液； 風(fēng)干土制備10－1 至10－4 稀釋液；

2．分離：

（1）細(xì)菌的分離（基內(nèi)接種）

a.．取9 個(gè)無菌平皿，用1ml 無菌吸管分別吸取0.1ml 10－4、10－5 及10－6 潮濕土的土壤稀釋液，接入平皿，每一稀釋度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，

b．將已融化并冷卻至45℃左右的細(xì)菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約15ml，共9 個(gè)平皿，與菌液充分混勻，凝固后，在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號(hào)及日期標(biāo)記；

c．將平板倒置，37℃培養(yǎng)2~3 天后觀察并計(jì)數(shù)。

（2）放線菌的分離（表面接種）

a．將已融化的150ml 高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入2 滴10%重鉻酸鉀溶液，充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約15ml，共9 個(gè)平皿，凝固后，在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號(hào)及日期標(biāo)記；

b．用1ml 無菌吸管分別取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 風(fēng)干土的土壤稀釋液，接入培養(yǎng)基表面，每一稀釋度3 個(gè)重復(fù)；

c．用無菌玻璃刮鏟，按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布，不要刮破培養(yǎng)基表面；

d．將平板倒置，37℃培養(yǎng)5~7 天后觀察并計(jì)數(shù)。

（3）真菌的分離（表面接種）

a．將已融化的150ml PDA 培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，加入0.3ml *溶液（1000?/ml），充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約15ml，共9 個(gè)平皿，凝固后，在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號(hào)及日期標(biāo)記；

b．用1ml 無菌吸管分別取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 潮濕土的土壤稀釋液，接入培養(yǎng)基表面，每一稀釋度3 個(gè)重復(fù)；

c．用無菌玻璃刮鏟按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布，不要刮破培養(yǎng)基表面；

d．將平板倒置，26℃~28℃培養(yǎng)3 天后觀察并計(jì)數(shù)。

結(jié)果

1．活菌計(jì)數(shù)：

計(jì)數(shù)時(shí)通常選用每種微生物生長(zhǎng)的zui適稀適度的三個(gè)平皿計(jì)數(shù)， 如細(xì)菌、放線菌和酵母菌以每皿30~300 個(gè)菌落為宜，絲狀真菌則以每皿10~100 個(gè)菌落為宜。將原始結(jié)果填入下表，根據(jù)事先測(cè)定的土壤含水量，按公式計(jì)算出每個(gè)干土中微生物的量。

2．檢查每皿中的優(yōu)勢(shì)菌種，可根據(jù)菌落特征、制水壓片、染色制片等觀察菌體形態(tài)；

3．純培養(yǎng)：記錄優(yōu)勢(shì)菌株的菌落特征并編號(hào)，然后將其劃線接入試管斜面。根據(jù)已掌握的知識(shí)進(jìn)行判斷，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，真菌用PAD培養(yǎng)基。見圖24-3。分別在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上劃線分離單菌落，待長(zhǎng)好后再次劃線接入試管斜面，以備鑒定、保存使用。