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蛋白測(cè)序的原理、步驟、以及N端測(cè)序服務(wù)的注意事項(xiàng)

時(shí)間:2013-9-13閱讀:1253
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蛋白測(cè)序 的主要策略是采用化學(xué)或者酶消化方法將多肽鏈拆分,然后測(cè)定氨基酸殘基含量和組成。本文詳述了蛋白質(zhì)測(cè)序的概念,蛋白測(cè)序的步驟以及蛋白N-端測(cè)序服務(wù)等。

一、概念

當(dāng)前,所謂蛋白質(zhì)測(cè)序 ,主要指的是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary structure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場(chǎng)合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序,它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái),現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬(wàn)個(gè)不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

二、測(cè)定步驟

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子 ,必須*行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起,稱為寡聚蛋白質(zhì),如,血紅蛋白為四聚體,烯醇化酶為二聚體;可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理,即可分開多肽鏈(亞基).

2 測(cè)定蛋白質(zhì)分子 中多肽鏈的數(shù)目。通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系,即可確定多肽鏈的數(shù)目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起,可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下,用過(guò)量的β-巰基乙醇處理,使二硫鍵還原為巰基,然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基,以防止它重新被氧化。

二硫鍵的切割與保護(hù)(元素后數(shù)字為下標(biāo))

a 過(guò)甲酸〔performic acid〕 不可逆

-CH2SO3H

b、還原+氧化 不可逆

[ 巰基乙醇,DTT ] + 碘乙酸等

-S-CH2-COOH

c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

-R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通過(guò)加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力;應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

巰基(-SH)的保護(hù)

作用:這些反應(yīng)(見(jiàn)下圖)可用于巰基的保護(hù)。

4 測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成,并計(jì)算出氨基酸成分的分子 比(如下圖)

5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

多肽鏈端基氨基酸分為兩類:N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中,zui重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法),C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法)。

6 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段??刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片,并將其分離開來(lái)。

7 測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序

8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊,拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

一般采用*處理沒(méi)有斷開二硫鍵的多肽鏈,再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段,用過(guò)甲酸處理后,將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析,然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較,確定二硫鍵的位置。

三、蛋白質(zhì)N-端測(cè)序服務(wù)

幾乎所有的蛋白合成都起始于N-端,蛋白質(zhì)N-端的序列組成對(duì)于蛋白質(zhì)整體的生物學(xué)功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期,同時(shí)關(guān)聯(lián)著蛋白亞細(xì)胞器定位等,這些與蛋白的功能和穩(wěn)定息息相關(guān),對(duì)蛋白進(jìn)行N-端測(cè)序分析,有利于幫助分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

目前對(duì)蛋白N端測(cè)序主要分類兩大類,其一為非質(zhì)譜技術(shù),例如經(jīng)典的Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對(duì)應(yīng)蛋白的cDNA,再來(lái)反推得到蛋白序列;其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用的長(zhǎng)處和制約之處,目前,市面上采用的,依然是基于經(jīng)典的Edman降解法原理,利用美國(guó)ABI公司Procise491蛋白序列測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行蛋白N-端測(cè)序。

蛋白質(zhì)N-端測(cè)序服務(wù)說(shuō)明

基于Edman降解法原理進(jìn)行蛋白質(zhì)N-端測(cè)序,從理論上不可避免的受到兩種條件制約,會(huì)很大程度上影響蛋白測(cè)序質(zhì)量:

1、樣品純度不能太低,經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為純度大于90%的蛋白才適用于測(cè)序反應(yīng)。

2、N端封閉或糖基化的蛋白質(zhì)難以進(jìn)行Edman反應(yīng),無(wú)法測(cè)序。

蛋白質(zhì)合成是從N末端開始的,因此分析蛋白質(zhì)合成是從N末端序列對(duì)蛋白序列分析很重要,蛋白質(zhì)N端序列主要是通過(guò)Edman降解法和質(zhì)樸技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。

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