（1）肽庫：美國NewEnglandBiolabs的環(huán)狀7肽庫（Ph，D-C7CTm Phage Display Peptide LibraryKit）。

    （2）人正常細(xì)胞株和人腫瘤細(xì)胞株。

    （3）裸鼠。

 

    2．實(shí)驗(yàn)器材和常用試劑

    同蛋白質(zhì)分子為篩選靶目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法。

 

    3．實(shí)驗(yàn)方法

    1）目標(biāo)噬菌體的初篩

    （1）荷瘤裸鼠動物模型的準(zhǔn)備：選用4～6周齡雌性健康BALB/c裸鼠數(shù)只，于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)無菌培養(yǎng)，待用。選取生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞，*常規(guī)消化后用含有20％新生牛血清的RPMll640*培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度達(dá)到10⁷個(gè)細(xì)胞/ml。將重懸好的細(xì)胞，用1m1的無菌一次性注射器在裸鼠右側(cè)腋下，采用皮下注射的方法將200ul（約5×10⁶個(gè)）的腫瘤細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。約3～4周后腫瘤達(dá)到可供使用的大小。

    （2）荷瘤裸鼠經(jīng)乙mi麻醉后，將10¹¹噬菌體肽文庫靜脈注射人荷瘤裸鼠體內(nèi)（這些噬菌體經(jīng)過血液循環(huán)后，含肝癌細(xì)胞特異性肽的噬菌體將會吸附于肝癌細(xì)胞上或被癌細(xì)胞內(nèi)吞），5min后用10ml的DMEM、100m1生理鹽水對小鼠進(jìn)行心臟灌流。取出裸鼠一部分腫瘤組織用PBS洗3次，研磨后，加入20 ml預(yù)先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37℃、230r/rain振蕩培養(yǎng)4．5h，分別檢測從腫瘤回收的噬菌體及其擴(kuò)增后的效價(jià)。

    （3）荷瘤裸鼠繼續(xù)用多聚甲醛固定液灌流至肝臟變白，取下荷瘤裸鼠的主要器官和一部分腫瘤組織，浸入3％多聚甲醛固定，以備組織切片用。

    （4）從裸鼠的腫瘤組織回收噬菌體含有能特異性吸附于腫瘤組織的多肽，對回收得到的噬菌體庫用上述相同的方法再進(jìn)行1次體內(nèi)循環(huán)篩選，即得到了初篩的目標(biāo)噬菌體。

 

    2）噬菌體單克隆的擴(kuò)增及純化：同以細(xì)胞為靶目標(biāo)的篩選。

 

    3）目標(biāo)噬菌體克隆的鑒定

    （1）噬菌體在體內(nèi)組織分布的免疫組織化學(xué)鑒定：取出浸在3％多聚甲醛中的組織樣品，自然干燥后，切片后貼到玻片上，晾干，丙酮固定5rain，PBST洗3次，每次3min。1％過氧化氫甲醇混合液室溫浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。5％脫脂奶粉室溫封阻20rain，加入按1：1 000稀釋的噬菌體M13抗血清，37℃濕盒中溫育1h，PBST洗3次，每次5rain。加入1：300稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃濕盒中溫育1 h，PBST洗3次，每次5rain。DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)（約12 rain），用流水終止反應(yīng)；蘇木青復(fù)染細(xì)胞核約3rain，自來水沖洗；加飽和*分色，用乙醇逐級脫水，二甲苯3rain透明，zui后用中性樹脂封片觀察。

    （2）體外培養(yǎng)細(xì)胞水平的鑒定：同以細(xì)胞為靶目標(biāo)的篩選。