碧云天的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱(chēng)乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性時(shí)釋放的乳酸 脫氫酶活性或檢測(cè)其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。
本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測(cè)，更常用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)。同時(shí)，基于細(xì)胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測(cè)，本試劑盒也可以用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)。
細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過(guò)檢測(cè)從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。LDH釋放被認(rèn)為是以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過(guò)51Cr釋放進(jìn)行 細(xì)胞膜完整性檢測(cè)的安全有效的替代方法。
本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT (2- p -iodophenyl-3-
nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD +和強(qiáng)生色物甲臜(formazan)，在490nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過(guò)比色來(lái)定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下：

可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。一個(gè)試劑盒可進(jìn)行100次檢測(cè)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。C0016-3需注意避免反復(fù)凍融。C0016-4需避光保存。試劑盒解凍后可以短期4℃存放，2-3天內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)：
冷凍會(huì)使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測(cè)定。
如果檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過(guò)1%，并使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢 測(cè)時(shí)一定要設(shè)置沒(méi)有細(xì)胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對(duì)照孔，以用于消除背景。
細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、密度過(guò)高、離心速度過(guò)大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過(guò)大，都會(huì)造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。
如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的定量，用戶(hù)需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。

使用說(shuō)明：
1.樣品的準(zhǔn)備：
方法一：LDH釋放檢測(cè)
a.根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿(mǎn)。
b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔(樣品對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品酶活性對(duì)照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時(shí)間，對(duì)照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇?duì)照)，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品max酶活性對(duì)照孔"中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。
c.到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測(cè)
a.細(xì)胞毒性檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿(mǎn)。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。
b.細(xì)胞增殖檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過(guò)80-90%滿(mǎn)為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻胞，然后繼續(xù)在細(xì)培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。
注：LDH釋放檢測(cè)更加常用一些，細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測(cè)通?？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。
2.  試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a.INT溶液(1X)的配制：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT 稀釋液，混勻后即配制為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配制后凍存。
b.LDH檢測(cè)工作液的配制: 根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的檢測(cè)工作液。
注意：LDH檢測(cè)工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過(guò)程中均要注意適當(dāng)避光。

c.(選做)如果希望進(jìn)行LDH酶活性的定量，需自備LDH標(biāo)準(zhǔn)品，并新鮮配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、 0.65mU/ml、0 mU/ml。

3. 樣品測(cè)定:
a.各孔分別加入60μl LDH檢測(cè)工作液。
b.混勻，室溫(約25℃) 避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng))。然后在490nm處測(cè)定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。
c.計(jì)算(測(cè)得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對(duì)照孔吸光度)
d.細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度) / (細(xì)胞酶活性的吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)×100
e.可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計(jì)算該藥物作用特定時(shí)間的半致死劑量LD50。

附錄1：
可同時(shí)測(cè)定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計(jì)算出樣品中LDH酶活力：
待測(cè)樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝
(樣品孔吸光度－背景空白對(duì)照孔吸光度) / (標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/ml)；
根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異等。

附錄2：
若需準(zhǔn)確計(jì)算出LDH酶活性的活性，可通過(guò)一系列LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測(cè)得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)公式計(jì)算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數(shù)值減去空白對(duì)照后，以檢測(cè)的吸光度(OD490)為縱坐標(biāo)，LDH酶活力(mU)為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)計(jì)算出該趨勢(shì)線的公式。

A_490nm＝k×LDH酶活力單位(mU)＋b，通過(guò)Excel等軟件計(jì)算 出趨勢(shì)線的斜率k和截距b。
根據(jù)上述公式計(jì)算樣品中LDH活力。
樣品實(shí)際吸光度(OD490)＝樣品孔測(cè)得的吸光度－背景空白對(duì)照孔吸光度
檢測(cè)體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)＝檢測(cè)體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測(cè)樣品體積