樣品實驗方案

1.制備含胺蛋白質(zhì)的綴合緩沖液，蛋白質(zhì)-NH 2 （緩沖液A）：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.2）或pH值為7.2至8.0的其他無胺緩沖液可用于此。

注意：避免在綴合過程中含有伯胺（如Tris或甘an酸）和巰基的緩沖液，因為它們會與預(yù)期的反應(yīng)競爭。如有必要，將樣品透析或脫鹽至適當(dāng)?shù)木彌_液如PBS中。

2.制備含巰基蛋白質(zhì)的綴合緩沖液，蛋白質(zhì)-SH（緩沖液B）：pH為6.5-7.5的不含巰基的緩沖液可用于此。

注1：在綴合過程中避免使用含有巰基的緩沖液，因為它們會與預(yù)期的反應(yīng)競爭。如有必要，將樣品透析或脫鹽至適當(dāng)?shù)木彌_液如PBS中。

注2：加入1-5mM EDTA有助于螯合二價金屬，從而減少含巰基蛋白質(zhì)中的二硫化物形成。

3.準(zhǔn)備脫鹽柱，將改性蛋白與過量交聯(lián)劑和反應(yīng)副產(chǎn)物分離。

4.在其綴合緩沖液A和緩沖液B中制備含胺蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)-NH2）和含巰基蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)-SH）溶液。

5.制備蛋白質(zhì)1-NH 2 -SMCC（或SMCC Plus）綴合物：將適量的SMCC（或SMCC Plus）加入到緩沖液A中的含胺蛋白質(zhì)溶液中。蛋白質(zhì)-NH 2的濃度 決定SMCC（或SMCC Plus）摩爾過量使用。SMCC（或SMCC Plus）摩爾過量的建議體積如下，但佳比例必須使用目標(biāo)蛋白質(zhì)通過實驗確定：

• 蛋白質(zhì)樣品<1 mg / mL使用40-80倍摩爾過量。

• 1-4 mg / mL的蛋白質(zhì)樣品使用20倍摩爾過量。

• 5-10 mg / mL的蛋白質(zhì)樣品使用5至10倍摩爾過量。

6.將上述反應(yīng)混合物在室溫下孵育30-60分鐘或在4℃孵育2-4小時。

注1：為了在完成前停止綴合反應(yīng)，加入含有還原半胱an酸的緩沖液，其濃度比Protein-SH的巰基濃度高幾倍。

注2：可以通過電泳分離和隨后的蛋白質(zhì)染色來估計綴合效率。

7.使用用共軛緩沖液A平衡的脫鹽柱除去多余的SMCC（或SMCC Plus）。

8.將含硫醇（蛋白-SH）和脫鹽的含胺蛋白（蛋白-NH 2）SMCC（或SMCC Plus）綴合物混合并混合，摩爾比對應(yīng)于終綴合物所需的摩爾比，并與親屬一致兩種蛋白質(zhì)上存在的巰基和活化胺的數(shù)量。

注意：與馬來酰亞胺部分反應(yīng)的分子必須具有游離（還原的）巰基。對于蛋白質(zhì)，在室溫下使用5mM TCEP還原二硫鍵30分鐘，然后通過合適的脫鹽柱兩次。請注意，蛋白質(zhì)（例如抗體）可能會通過全部還原其二硫鍵而失活?？梢杂?-巰基乙胺·HCl（2-MEA）實現(xiàn)IgG中鉸鏈區(qū)二硫鍵的選擇性還原?？梢允褂肗-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）或2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷·鹽酸鹽（Traut's Reagent）將巰基化合物添加到分子中，后者可以修飾伯胺。