樣品實(shí)驗(yàn)方案

1.制備用于含胺蛋白質(zhì)的綴合緩沖液，蛋白質(zhì)-NH 2（緩沖液A）：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.2）或pH 7.2至8.0的其他無(wú)胺緩沖液可用于此目的。 注意：避免在綴合過(guò)程中含有伯胺（如Tris或甘an酸）和巰基的緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與預(yù)期的反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。如有必要，將樣品透析或脫鹽至適當(dāng)?shù)木彌_液如PBS中。 

2.制備含巰基蛋白質(zhì)的綴合緩沖液，蛋白質(zhì)-SH（緩沖液B）：pH 6.5-7.5的無(wú)巰基緩沖液可用于此目的。 注意：避免在綴合過(guò)程中含有巰基的緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與預(yù)期的反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。如有必要，將樣品透析或脫鹽至適當(dāng)?shù)木彌_液如PBS中。 注意：添加1-5 mM EDTA有助于螯合二價(jià)金屬，從而減少含巰基蛋白質(zhì)中二硫化物的形成。 

3.準(zhǔn)備脫鹽柱以將修飾的蛋白質(zhì)與過(guò)量的交聯(lián)劑和反應(yīng)副產(chǎn)物分離。 

4.在其共軛緩沖液A和B中制備含胺（蛋白質(zhì)-NH 2）和含巰基蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)-SH）溶液。 

5.制備蛋白質(zhì)＃1-SMCC Plus 綴合物：將適量的SMCC Plus 添加到緩沖液A中的蛋白質(zhì)＃1溶液中。蛋白質(zhì)-NH 2的濃度決定了所需的SMCC Plus 的摩爾比。所需的SMCC Plus 量建議如下，但佳比例必須通過(guò)使用目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定：

5.1 蛋白質(zhì)樣品<1 mg / mL使用40-80倍摩爾過(guò)量。

5.2 1-4mg / mL的蛋白質(zhì)樣品使用20倍摩爾過(guò)量。

5.3 5-10mg / mL的蛋白質(zhì)樣品使用5至10倍摩爾過(guò)量。 

6.將上述反應(yīng)混合物在室溫下孵育30-60分鐘或在4℃孵育2-4小時(shí)。 注意：為了在完成前停止綴合反應(yīng)，加入含有還原半胱an酸的緩沖液，其濃度比Protein-SH的巰基高幾倍。 注意：可以通過(guò)電泳分離和隨后的蛋白質(zhì)染色來(lái)估計(jì)綴合效率。 

7.使用用共軛緩沖液A平衡的脫鹽柱除去多余的SMCC Plus 。 

8.將含巰基的（Protein-SH）和脫鹽的含胺蛋白（Protein-NH 2）-SMCC Plus 綴合物以終綴合物所需的摩爾比混合并混合，并與巰基和活化的相對(duì)數(shù)量一致存在于兩種蛋白質(zhì)上的胺。 注意：與馬來(lái)酰亞胺部分反應(yīng)的分子必須具有游離（還原的）巰基。對(duì)于蛋白質(zhì)，在室溫下使用5mM TCEP還原二硫鍵30分鐘，然后通過(guò)合適的脫鹽柱兩次。請(qǐng)注意，蛋白質(zhì)（例如抗體）可能會(huì)通過(guò)全部還原其二硫鍵而失活?？梢杂?-巰基乙胺·HCl（2-MEA）實(shí)現(xiàn)IgG中鉸鏈區(qū)二硫鍵的選擇性還原。可以使用N-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）或2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷·HCl（Traut's Reagent）將巰基化合物添加到分子中，其改性伯胺。