胱天蛋白酶Caspase 9熒光底物Ac-LEHD-AMC 藍(lán)是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的熒光底物，Caspase 9是半胱*酸蛋白酶家族中CED-3亞家族成員，在凋亡起始階段占有必要地位。這些酶主要具有特異的保守性區(qū)域，并特異的切開識(shí)別位點(diǎn)后面的天冬氨酸殘基。起始凋亡蛋白酶（例如caspases-8）效應(yīng)蛋白酶，例如caspase-3或者-7。這些效應(yīng)蛋白酶然后酶切細(xì)胞底物導(dǎo)致凋亡的形態(tài)學(xué)改變。AC-LHED-AMC是caspase-9選擇性熒光底物。Caspase-9酶切水解特異性底物AC-LHED-AMC，導(dǎo)致釋放AMC熒光集團(tuán)，其激發(fā)波長(zhǎng)是365nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備試驗(yàn)緩沖液包含50nM MES，pH6.5,10%PEG8000, 0.1% CHAPS, 5 mM DTT, and 1 mM EDTA.。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的胱天蛋白酶Caspase 9熒光底物Ac-LEHD-AMC 藍(lán)。

樣品實(shí)驗(yàn)方案

以下說(shuō)明書僅提供指南，實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

1.使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的一般溶液Caspase測(cè)定

1.1在DMSO中制備10mM儲(chǔ)備溶液。

1.2制備2X半胱天冬酶底物（50μM）測(cè)定溶液，如下所示：

50 uL基質(zhì)原液

100L DTT（1M）

400L EDTA（100 mM）

10mL Tris緩沖液（20mM），pH = 7.4

1.3將等體積的半胱天冬酶標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液（來(lái)自步驟1.2）混合，并在室溫下孵育溶液至少1小時(shí)。

1.4使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光，或使用吸光度酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

2.細(xì)胞Caspase檢測(cè)使用細(xì)胞滲透FMK半胱天冬酶探針

2.1在DMSO中制備2-5mM儲(chǔ)備溶液。

2.2根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

2.3通過(guò)用20mM Hepes緩沖液（HHBS）稀釋Hanks中的DMSO儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟2.1），制備2X可滲透的半胱天冬酶底物（20μM）測(cè)定溶液。

2.4用2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液（來(lái)自步驟2.3）混合等體積的處理細(xì)胞，并將細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育至少1小時(shí)。

2.5用HHBS洗滌細(xì)胞至少一次。

2.6用流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

3.細(xì)胞Caspase檢測(cè)使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針（僅適用于＃13470-13476）

3.1通過(guò)向小瓶中加入50μLDMSO制備250X儲(chǔ)備溶液。

3.2根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

3.3將250 X DMSO儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟3.1）以1：250的比例（例如2 uL至500 uL細(xì)胞）添加到細(xì)胞溶液中，并將細(xì)胞在37°C，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1 小時(shí)。

3.4用HHBS洗滌細(xì)胞至少一次。

3.5用流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。