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宿主細(xì)胞殘留 DNA 樣本前處理試劑盒(磁珠法)

試劑盒簡介：

宿主細(xì)胞殘留 DNA 樣本前處理試劑盒(磁珠法)用于樣本的前處理，可穩(wěn)定高效地提 取出樣本中殘留的痕量宿主 DNA。

試劑盒組分：

有效期： 12 個月

宿主細(xì)胞殘留 DNA 樣本前處理試劑盒實驗流程(手工操作)：

注： 在開展實驗前， 請用精密 pH  試紙條測定樣本的 pH 值并將樣本 pH 值調(diào)節(jié)至 6-8.

實驗準(zhǔn)備

↓

樣本準(zhǔn)備

↓

樣本消化

↓

DNA 捕獲

↓

洗滌

↓

DNA 洗脫

實驗操作細(xì)則：

一、 樣本處理：

1.   取 100ul 待檢樣本至 1.5ml 干凈的離心管中，加入 10ul 5M  NaCl  溶液，用渦旋      振 蕩器充分震蕩 10 秒；

2.   加入 10ul 蛋白酶 K，在渦旋振蕩器上充分震蕩 10 秒；

3.  配制新鮮的裂解液，其組成為： 130ul  裂解液/100ul  樣本， 9ul  肝糖原/100  樣本， 0.2ul tRNA/100ul 樣本，充分混勻以制成新鮮配制的裂解液；

4.  將 139ul 新鮮配制的裂解液加入到樣本管中， 然后用渦旋振蕩器充分震蕩 10 秒， 取出短 暫快速離心 5 秒，然后放置在 56oC 孵育 30 分鐘；

二、 DNA 捕獲：

1.     將磁珠充分渦旋振蕩以*重懸；

2.     將樣本管從孵育器中取出， 進(jìn)行簡短的離心，將液體收集到管底，然后加入*重懸的 磁珠 60ul 和 230ul 結(jié)合液，在渦旋振蕩器上充分震蕩 10 秒； (注意： 在加入磁珠時， 需經(jīng) 常振蕩重懸磁珠， 以保證吸取時磁珠的均勻性。建議每加 3-4 組樣本后， 重懸磁珠后再進(jìn)行 后續(xù)樣本的添加)

3.    將震蕩后的樣本管，置于旋轉(zhuǎn)混勻器或渦旋振蕩器上 10 分鐘以進(jìn)行磁珠捕獲；

4.     將樣本管從旋轉(zhuǎn)混勻器上取下，在 10000g 的條件下離心 1 分鐘使磁珠充分聚集；

5.     將離心后的樣本管置于磁力架上， 待溶液*澄清后， 用槍頭小心移去上清(注： 避免 槍頭攪動磁珠，使得磁珠同上清一起被除去從而影響得率)；

三、宿主細(xì)胞殘留 DNA 樣本前處理試劑盒 洗滌：

1.     樣本管移去上清后，不必將樣本管從磁力架上取下，直接加入 400ul 洗滌液；

2.     待溶液*澄清后，磁珠*分離，用槍頭小心移去上清；

3.     保持樣本管在磁力架上， 加入 400ul 洗滌液， 待溶液澄清， 磁珠*分離后， 用槍頭小 心移去上清；

4.     將樣本管從磁力架上取下， 于 10000g 的條件下離心 30 秒，使得殘留的洗滌液*聚集 到管底；

5.   將樣本管置于磁力架上，待磁珠*分離后，用 10ul 槍頭小心移除殘留的液體；

6.     將樣本管從磁力架上取下，置于 70oC 金屬浴中，放置 4 分鐘， 除去殘留的乙醇(注： 若干燥不夠， 殘留的乙醇會影響后續(xù)的定量檢測反應(yīng))；待磁珠團(tuán)出現(xiàn)裂紋時，將樣本管從 金屬浴中取出進(jìn)行 DNA 洗脫；

四、 DNA 洗脫：

1.     沿著樣本管的管壁加入 50- 100ul 洗脫液，用 100ul 的槍頭反復(fù)吹吸，以*重懸磁珠；

2.     將樣本管置于 70oC 孵育器孵育 10 分鐘；

3.   將樣本管從孵育器中取出，于 20000g 離心 2 分鐘，然后至于磁力架上，待磁珠*分 離后，用 10ul 槍頭小心將上清液體轉(zhuǎn)移至新的干凈的離心管中；

4.    為了避免吸入磁珠，在離心管中還剩余少量液體時，將其于 20000g 離心 2 分鐘，然后 至于磁力架上以吸出剩余的液體。

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