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索氏梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)方法包括以下步驟

閱讀:2361      發(fā)布時(shí)間:2024-8-22
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索氏梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)方法包括以下步驟:

(1)將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接,克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品,并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線;

(2)待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后,目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù),計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值,即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。

其中步驟(1)為:將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接,克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品,并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因,較佳地管家基因,優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域,其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體,較佳地為PCR克隆載體,優(yōu)選地為TA cloning載體,所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1:1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1,解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題,提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。

步驟(2)為:待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后,目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù),計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值,即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。

其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因,較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因,更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域,所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法,所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增,更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。


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