過氧亞硝酸鹽（ONOO-）是一種強氧化劑，是一種高活性硝化劑。過氧亞硝酸鹽是由細胞中產(chǎn)生的超氧自由基與一氧化氮之間的反應(yīng)形成的。它可以破壞各種各樣的生物分子，包括蛋白質(zhì)，酶，脂質(zhì)和核酸，zui終導(dǎo)致細胞死亡。由于其極短的半衰期和低的穩(wěn)態(tài)濃度，因此檢測和定量溶液中的過氧亞硝酸鹽一直是一項挑戰(zhàn)。為了滿足這一需求，AAT Bioquest的Amplite™熒光過氧亞硝酸鹽定量試劑盒提供了一種靈敏的工具來測量溶液中的ONOO-。DAX-J2™PON Green 99與ONOO-反應(yīng)生成亮綠色熒光產(chǎn)物。特別是它與ONOO-發(fā)生反應(yīng)，對其他活性氧（ROS）和活性氮（RNS）具有高選擇性。該套件可與熒光酶標(biāo)儀和光譜儀一起使用。

1. 準備過氧亞硝酸鹽標(biāo)準和/或測試樣品（50 µL）

2. 添加過氧亞硝酸鹽工作溶液（50 µL）

3. 在室溫下孵育5-10分鐘

4. 在Ex / Em = 490/530 nm處監(jiān)控?zé)晒?/p>

重要說明
使用前，將所有套件組件解凍至室溫。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，制備后應(yīng)儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. DAX-J2™PON Green 99儲備溶液（500X）：
將20 µL DMSO（組分C）添加到DAX-J2™PON Green 99（組分A）小瓶中，制成500X儲備溶液。注意：20 µL的重新配制的DAX-J2™PON Green 99儲備溶液足以容納1個板。遠離光線。

2.過氧亞硝酸鹽（ONOO）儲備溶液（未提供）：
根據(jù)文獻報道合成過氧亞硝酸鹽儲備溶液。簡而言之，用鹽酸（0.6M）酸化yaxiaosuanna（0.6M）和過氧化氫（0.7M）的混合物，并在1-2秒內(nèi)加入氫氧化鈉（1.5M）以使溶液呈堿性。使溶液通過短的二氧化錳柱除去過量的過氧化氫。過氧亞硝酸鹽溶液在0.1 M NaOH中的消光系數(shù)在302 nm下為1670 M ^-1 cm ^-1。ONOO的儲備溶液不穩(wěn)定。我們強烈建議使其新鮮使用。

配制標(biāo)準溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

在測定緩沖液（組分B）中稀釋過氧亞硝酸鹽（ONOO）儲備液，以得到20 µM ONOO標(biāo)準溶液，然后進行1：2系列稀釋，以得到系列稀釋的ONOO標(biāo)準溶液（O7-O1）。

準備工作溶液

將20μL的500X DAX-J2™PON Green 99儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中并充分混合。注意：此分析混合物足以用于一個96孔板。避光。