ADP-核糖-pNP是用于評(píng)估聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）酶活性的比色底物。在405 nm處測(cè)定釋放的對(duì)硝基benfen的吸光度，并使用校準(zhǔn)曲線的斜率將吸光度轉(zhuǎn)換為生成的產(chǎn)物的摩爾數(shù)。以ADP-核糖-pNP作為比色底物，確定PARP-1具有zui大的Km和Vmax值（分別為151 uM和1.30 nmolmin-1mg-1），然后是tankyrase-1（82 uM和18 pmolmin-1mg-）。 1）和VPARP（分別為46 uM和2 pmolmin-1mg-1）。此比色底物可用于確定PARP-1，tankyrase-1和VPARP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并篩選PARP-1，tankyrase-1和VPARP的小分子抑制劑。與標(biāo)準(zhǔn)的不連續(xù)PARP分析相比，基于ADP-核糖-pNP的連續(xù)分析具有明顯的優(yōu)勢(shì)，

以下建議的步驟可適用于測(cè)量PARP-1，tankyrase-1和VPARP活性及其抑制劑。對(duì)于每個(gè)測(cè)試，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定*條件。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. ADP-核糖-pNP儲(chǔ)備溶液：
在H ₂ O中制成5-10 mM儲(chǔ)備溶液。注意：儲(chǔ)備溶液應(yīng)立即使用。

準(zhǔn)備工作溶液

ADP-核糖-pNP工作溶液：
用測(cè)定緩沖液（50mM Tris，10mM MgCl ₂，pH 8.0）稀釋儲(chǔ)備液，制備0.25 mM測(cè)定溶液。

程序

1. 將0.01 mL /孔的樣品溶液添加到0.09 mL /孔的測(cè)定溶液中，以在96孔透明板上zui終體積為0.1 mL。
   

2. 使用酶標(biāo)儀在405 nm處監(jiān)測(cè)板。

普通儲(chǔ)備溶液的制備

表1.將特定質(zhì)量的ADP-核糖-pNP重構(gòu)為給定濃度所需的水量。請(qǐng)注意，該體積僅用于制備儲(chǔ)備溶液。有關(guān)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)/生理緩沖液，請(qǐng)參閱樣本實(shí)驗(yàn)方案。

糖度計(jì)算器

輸入任何兩個(gè)值（質(zhì)量，體積，濃度）以計(jì)算第三個(gè)值。