1 主題內容與適用范圍
本標準規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗方法。
本標準適用于出口食品的檢驗。
2 設備和材料
2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培養(yǎng)箱：36±1℃,44.5±0.5℃。
2.4 冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均質器。
2.6 乳缽和研棒。
2.7 平皿：直徑90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 顯微鏡。
2.10 稀釋瓶：100mL、200mL和500mL三角燒瓶及廣口瓶。
2.11 玻璃珠：直徑約5mm。
2.12 菌落計數(shù)器。
3 培養(yǎng)基及試劑
3.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示）（LST）肉湯。
3.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯。
3.3 EC 肉湯。
3.4 伊紅美藍瓊脂（EMB）。
3.5 營養(yǎng)瓊脂斜面。
3.6 *肉湯。
3.7 MR-VP培養(yǎng)基。
3.8 Korser氏枸椽酸鹽肉湯。
3.9 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）。
3.10 Butterfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液。
3.11 生理鹽水。
3.12 革蘭氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基質試劑。
3.14 甲基紅指示劑。
3.15 Voges-pros kauer（V-P）試劑。
4 樣品制備
4.1 以無菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用75％乙醇在開口處擦拭后取樣。若不能及時檢驗,應將冷凍樣品置于-15℃保存；非冷凍而易腐的食品,應置于4℃冰箱保存。檢驗前冷凍樣品可于2～5℃ 18h內解凍,或在45℃以下15min內解凍。
4.2 不同食品樣品勻液的制備
4.2.1 液體食品
以滅菌吸管取樣25mL放入裝有225mL稀釋劑的滅菌玻璃瓶（瓶內預置適當數(shù)量的玻璃珠）,以30cm幅度、于7s內振搖25次（或以機械振蕩器振搖）,制成1:10的樣品勻液。
4.2.2 固體和半固體食品
以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質杯內,于8000 r/min均質1～2min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代替）。
4.3 稀釋樣品勻液根據(jù)對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。
5 大腸菌群的測定
5.1 大腸菌群MPN值的測定
5.1.1 對每個樣品,選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示）（LST）肉湯,每管接種1mL。
5.1.2 將接種管置于36±1℃培養(yǎng)48±2h。
5.1.3 觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生,記錄在24h和48h內產氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產氣,則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者,則進一步作證實試驗。
5.2 大腸菌群的證實試驗
5.2.1 將所有產氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。
5.2.2 置BGLB肉湯管于36±1℃培養(yǎng)48±2h。
5.2.3 記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數(shù)。
5.2.4 結果報告：按BGLB肉湯產氣管數(shù),查MPN表[見附錄B （補充件）]報告每克（毫升）樣
品中大腸菌群的MPN值。
6 糞大腸菌群測定
6.1 用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。
6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養(yǎng)24±2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養(yǎng)基液面。應以已知為44.5℃產氣陽性的大腸桿菌和44.5℃不產氣的產氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。
6.3 記錄EC肉湯管的產氣情況。產氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產氣管為糞大腸菌群試驗陰性。
6.4 結果報告：按產氣管數(shù),查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。
7 大腸桿菌測定
7.1 將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h,取其產氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍（EMB）平板,36±1℃培養(yǎng)24±2h。
7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
7.3 如有典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1℃培養(yǎng)18～24h。
7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗。
7.4.1 *肉湯：在36±1℃培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質陽性反應。
7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗陽性。
將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。
7.4.3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養(yǎng)96h記錄有無生長。
7.4.4 LST肉湯：于36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產氣。
7.4.5 革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。
7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
靛 基 質┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸鹽 ┃ 鑒定（型別）
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
?。々А ?＋ ┃ ?。? ┃ ?。? ┃典型大腸桿菌
?。々? ?。? ┃ ?。? ┃ ?。? ┃非典型大腸桿菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
?。々А ?＋ ┃ － ┃ ?。? ┃典型中間型
?。々А ?＋ ┃ ?。? ┃ ＋ ┃非典型中間型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
?。々А ?－ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型產氣腸桿菌
?。々А ?－ ┃ ?。? ┃ ＋ ┃非典型產氣腸桿菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應重新劃線分離,必要時做重復試驗。
7.5 結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產酸產氣,IMViC試驗為＋＋--或－＋--,再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表,報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。
8 大腸菌群固體培養(yǎng)基測定法
8.1 樣品制備同第4章。
8.2 計數(shù)
8.2.1 選取適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品液,每個稀釋度接種兩個滅菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀釋劑加入一個滅菌平皿中,作空白對照。
8.2.2 將冷至45±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）10～15mL傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。
8.2.3 待瓊脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆蓋平板表層。
8.2.4 翻轉平板,置于36±1℃培養(yǎng)18～24h。
8.2.5 選用有30～150個菌落的平板,計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為0.5mm或更大。
8.2.6 證實
8.2.6.1 從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,移種于BGLB肉湯管內, 36±1℃培養(yǎng)24h和48h,觀察產氣情況。
8.2.6.2 將出現(xiàn)產氣的肉湯管判為大腸菌群陽性。對形成菌膜的陽性管,應進行革蘭氏染色,以便排除革蘭氏陽性桿菌。
8.2.7 結果報告
經(jīng)zui后證實為陽性（產氣,革蘭氏陰性桿菌） 的試管百分比乘以于8.2.5條中計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每克（毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。
例：10**-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接
種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為：
100×6/10×10**4/g（mL）＝6.0×10**5/g（mL）
附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
?。ㄑa充件）
A1 月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示）（LST）肉湯
胰蛋白（月示）或胰酪胨（Trypticase） 20g
氯化鈉 5.0g
乳糖 5.0g
*（K2HPO4） 2.75g
磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75g
月桂基硫酸鈉 0.1g
蒸餾水 1000.0mL
將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20mm×150mm試管中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。zui終pH6.8±0.2。
A2 煌綠乳糖膽鹽（BGAB）肉湯
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200.0mL
0.1％煌綠水溶液 13.3mL
蒸餾水 1000.0mL
將蛋白胨乳糖溶于約500mL蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中,pH7.0～7.5）,用蒸餾水稀釋到975mL,調pH7.4。再加入0.1％煌綠水溶液13.3mL,用蒸餾水補足到1000mL,用棉花過濾后,分裝到20mm×150mm試管（管內有倒立的小發(fā)酵管）中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。zui終pH7.2±0.1。
A3 EC肉湯
胰蛋白（月示）或胰酪（月示） 20.0g
3號膽鹽或混合膽鹽 1.5g
乳糖 5.0g
*（K2HPO4） 4.0g
磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.5g
氯化鈉 5.0g
蒸餾水 1000.0mL
將以上成分溶解于蒸餾水中,分裝16mm×150mm試管（管內有倒立的小發(fā)酵管）,每管8mL。121℃高壓滅菌15min,zui終pH6.9±0.1。
A4 伊紅美藍瓊脂（EMB）
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
*（K2HPO4） 2.0g
瓊脂 15.0g
伊紅γ（水溶性） 0.4g或2％水溶液20mL
美藍 0.065g或0.5％水溶液13mL
蒸餾水 1000.0mL
在1000mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂,加水補足至原量。分裝于三角燒瓶中。每瓶100mL或200mL,高壓滅菌15min。zui終pH7.1±0.2。使用前將瓊脂融化,于每100mL瓊脂中加5mL滅菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊紅γ水溶液和1.3mL0.5％的美藍水溶液,搖勻,冷至45～50℃傾注平皿。
A5 營養(yǎng)瓊脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1000.0mL
將各成分加于蒸餾水中,煮沸溶解。分裝合適的試管。121℃高壓滅菌15min。zui終pH7.3±0.1。滅菌后擺成斜面?zhèn)溆谩?/div>
A６ *肉湯
胰胨或胰酪胨 10.0g
蒸餾水 1000.0mL
加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管,每管5mL。121℃高壓滅菌15min。zui終pH6.9±0.2。
A7 MR-VP培養(yǎng)基
?。ㄔ率荆╇恕 ?.0g
葡萄糖 5.0g
*（K2HPO4） 5.0g
蒸餾水 1000.0mL
將各成分溶于蒸餾水中,分裝試管,121℃高壓滅菌15min,zui終pH6.9±0.2。
A8 Koser氏枸椽酸鹽肉湯
磷酸氫銨鈉（NaNH4HPO4·4H2O） 1.5g
*（K2HPO4） 1.0g
*（MgSO4·7H2O） 0.2g
枸椽酸鈉（含2H2O） 3.0g
蒸餾水 1000.0mL
將各成分溶解于蒸餾水中,分裝試管,每管10 mL,121℃高壓滅菌15min。zui終pH6.7±0.2。
A9 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化鈉 5.0g
膽鹽或3號膽鹽 1.5g
中性紅 0.03g
結晶紫 0.002g
瓊脂 15～18g
蒸餾水 1000.0mL
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分攪拌,調至pH7.4±0.1。煮沸2min,將培養(yǎng)基冷至45～50℃傾注平板。臨用時制備,不得超過3h。
A10 Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液
貯存液
磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0g
蒸餾水 500mL
將磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中,用1 mol/L氫氧化鈉約175 mL調至pH7.2。用蒸餾水加至1000mL貯存于冰箱。
稀釋液
取貯存液1.25mL, 用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于合適容器后,121℃高壓滅菌15min。
A11 生理鹽水
氯化鈉 8.5g
蒸餾水 1000.0mL
將氯化鈉溶于蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min。
A12 革蘭氏染色液
結晶紫染色液：
結晶紫 1.0g
95％乙醇 20.0mL
1％草酸銨水溶液 80.0mL
將結晶紫*溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
革蘭氏碘液：
碘 1.0g
* 2.0g
蒸餾水 300.0mL
將碘與*先行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待*溶解后,再加蒸餾水至300mL。
沙黃復染液：
沙黃 0.25g
95％乙醇 10.0mL
蒸餾水 90.0mL
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
染色法
a. 將涂片在火焰上固定,滴加結晶紫染液,染1min,水洗。
b. 滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗。
c. 滴加95％乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
d. 滴加復染液,復染1min,水洗、待干、鏡檢。
結果：革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。
A13 Kovacs氏靛基質試劑
對二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇 75.0mL
鹽酸（濃） 25.0mL
將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入濃鹽酸即可。
A14 甲基紅指示劑
甲基紅 0.1g
95％乙醇 300mL
將甲基紅溶解于300mL乙醇中,加水稀釋至500mL。
A15 Voges-Pros kauer（V-P）試劑
甲液
α-萘酚 5.0g
無水乙醇 100.0mL
乙液
氫氧化鉀 40.0g
用蒸餾水加至 100.0mL
附 錄 B
1g檢樣中zui近似值（MPN）表
（補充件）
使用三管法,接種量分別為0.1,0.01和0.001g。
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
陽 性 管 數(shù) ┃ ┃ 陽 性 管 數(shù) ┃
━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001 ┃ ｜ 0.1 0.01 0.001 ┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0 0 0 ┃ ＜3 ┃ 2 0 0 ┃ 9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃ 14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃ 20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃ 26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃ 15
0 1 1 ┃ 6.1 ┃ 2 1 1 ┃ 20
0 1 2 ┃ 9.2 ┃ 2 1 2 ┃ 27
0 1 3 ┃ 12 ┃ 2 1 3 ┃ 34
0 2 0 ┃ 6.2 ┃ 2 2 0 ┃ 21
0 2 1 ┃ 9.3 ┃ 2 2 1 ┃ 28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃ 35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃ 42
0 3 0 ┃ 9.4 ┃ 2 3 0 ┃ 29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃ 36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃ 44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃ 53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
1 0 0 ┃ 3.6 ┃ 3 0 0 ┃ 23
1 0 1 ┃ 7.2 ┃ 3 0 1 ┃ 39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃ 64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃ 95
1 1 0 ┃ 7.3 ┃ 3 1 0 ┃ 43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃ 75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃ 120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃ 160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃ 93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃ 150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃ 210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃ 290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃ 240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃ 460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃ 1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
注: ①本表采用3個稀釋度 [0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）],每個稀釋度接種3管。
②表內所列檢樣量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）時,表內數(shù)字應相應降低10倍；如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）和0.0001g（mL）時,則表內數(shù)字應相應增加10倍,其余類推。
