1范圍
SN / T 1933 的本部分規(guī)定了食品和水中腸球菌平板計數(shù)、zui近似值測定的檢驗方法。本部分適用于生活用水、生產(chǎn)加工用水及食品中腸球菌的檢驗。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過SN / T 1933 的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵根據(jù)本部分達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本部分。
GB / T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法
SN / T 0330 出口食品中微生物學(xué)檢驗通則
3 術(shù)語、定義和縮略語
3 .1術(shù)語和定義
下列術(shù)語、定義和縮略語適用于SN / T 1933 的本部分。
腸球菌Enterococci
一類革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，無芽胞和莢膜，可分解膽汁七葉苷。是評估食品、水、食品加工設(shè)備、食品生產(chǎn)環(huán)境等衛(wèi)生狀況的指標菌之一。
3 . 2 略縮語
3 . 2 . 1 BEA
膽汁七葉苷瓊脂。
3 . 2 . 2 BHIB
腦心浸液肉湯。
3 . 2 . 3 BHIA
腦心浸液瓊脂。
4 設(shè)備和材料
4.1電子天平：感量為0．001g 。
4.2恒溫水浴箱：46 ℃ 士1 ℃ 。
4.3恒溫培養(yǎng)箱：35℃士0.5℃，36℃士1℃，45℃ 士0.5℃，35℃士2℃ 。
4.4均質(zhì)器。
4.5振蕩器。
4.6移液管：容量1mL,10mL。
4.7培養(yǎng)皿。
5 培養(yǎng)基和試劑
實驗用水符合GB / T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法的要求。除另有規(guī)定外，試劑為分析純。
5 . 1*葡萄糖肉湯（見附錄第A.l章）。
5 . 2 腸球菌肉湯（見附錄第A . 2 章）。
5 . 3 KF 鏈球菌瓊脂（見附錄第A . 3 章）。
5 . 4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（見附錄第A . 4 章）
5 . 5 膽汁七葉苷瓊脂（BEA 瓊脂）（見附錄第A . 5 章）
5 . 6 腦心浸液肉湯（見附錄第A . 6 章）。
5 . 7 含6 . 5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯（見附錄第A . 7 章）。
5 . 8 腦心浸液瓊脂（見附錄第A . 8 章）。
5 . 9 緩沖蛋白胨水（見附錄第A．9 章）。
6 樣品制備
6 . 1抽樣數(shù)量及抽樣方法
抽樣數(shù)量及抽樣方法按SN / T 0330 進行。
6 . 2 樣品的貯存和運送
采樣后應(yīng)盡快進行檢驗，冷凍樣品如不能立即進行檢驗，應(yīng)置于-18 ℃ 保存。應(yīng)冷藏保存的待檢樣品在運送實驗室過程中應(yīng)于1 ℃ ~ -4 ℃ 保存。樣品采集后8h 之內(nèi)要完成檢驗。
6 . 3制樣
6 . 3 .1水及液體飲料：污染程度低的水及液體飲料可以直接進行檢驗；污染程度嚴重的水及液體飲料吸取25 mL 樣品，加人225 mL 緩沖蛋白胨水中，充分混勻，制成1：10 樣品勻液。
6 . 3 . 2 固體或半固體食品：無菌操作取25g樣品放人裝有225 mL 緩沖蛋白胨水的均質(zhì)杯內(nèi)，以8000r/min均質(zhì)1min~2 min ，制成1 : 10 樣品勻液。
6 . 3 . 3 以上樣品制備可根據(jù)樣品污染程度及檢驗需要，進一步制成功倍遞增的樣品稀釋液。
7 檢驗程序
食品和水中腸球菌平板計數(shù)法檢驗程序見圖1 。
25g （mL） + 225 mL 緩沖蛋白胨水
↓
10 倍梯度稀釋
↓
選擇2 個~3 個適宜連續(xù)稀釋度，各取1 mL 分別加入滅菌培養(yǎng)皿
↙ ↘
KF瓊脂36℃ 士1℃ 48h 士2h 腸球菌瓊脂35℃士2℃ 24h士2h
↘ ↙
確證實驗
↓
腸球菌陽性
↓
菌落計數(shù)及計算
↓
報告結(jié)果
食品和水中腸球菌zui近似值（MPN ）測定法檢驗程序見圖2 。
25g（mL ） + 225 mL 緩沖蛋白胨水
↓
10 倍梯度稀釋
↓
選擇3 個適宜連續(xù)稀釋度，各取1 ml 分別加入肉湯中
↙ ↘
*葡萄糖肉湯管 腸球菌肉湯管
37℃ 士1℃ , 24h~48h 35C 士2 ℃ 24h 士2h
↓ ↓ ↓ ↓
無混濁 混濁 變黑 不變黑
↓ ↓ ↓ ↓
腸球菌陰性 確證實驗 確證實驗 腸球菌陰性
↓ ↓
腸球菌陽性 腸球菌陽性
↘ ↙
MPN 值法報告腸球菌數(shù)／g（mI）
圖2 食品和水中腸球菌zui近似值（MPN）法的檢驗程序示意圖
8 檢驗步驟與計數(shù)
8 .1平板計數(shù)法
8 .1．1 適用范圍
此方法適用于檢驗未經(jīng)加工處理的生鮮食品及腸球菌菌數(shù)大于10 CFU / g （ mL ）的水和食品。
8 . 1 . 2 培養(yǎng)基制備
制備KF 瓊脂培養(yǎng)基或腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（參見第A . 3 章或第A . 4 章），傾注平板前將融化的培養(yǎng)基于46 ℃ 士1℃ 水浴保溫。
8 .1．3 接種和培養(yǎng)
8 . 1 . 3 . 1 根據(jù)樣品污染情況，選擇2 個~ 3 個適宜連續(xù)稀釋度的樣液，分別吸取1mL 稀釋液，加人培養(yǎng)皿中，每個稀釋度做兩個平板。
8 .1．3 . 2 稀釋液加人培養(yǎng)皿后，把保持46℃士l℃的KF瓊脂或腸球菌瓊脂15ml傾人培養(yǎng)皿內(nèi)，使樣液與培養(yǎng)基充分混合。水平放置，使瓊脂凝固。從制備zui初稀釋液結(jié)束到傾注培養(yǎng)基于zui后一個培養(yǎng)皿所用時間不應(yīng)超過20min。倒置平板進行培養(yǎng)，KF平板置36℃士l℃培養(yǎng)銘48h 士2h；腸球菌瓊脂平板置35 ℃士2℃培養(yǎng)24h士2h 。
8 .1．4 菌落形態(tài)觀察
腸球菌屬細菌在KF 平板上形成暗紅至粉紅色菌落，邊緣整齊；在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。用滅菌接種針從每個KF 平板或腸球菌瓊脂平板挑取10個典型菌落，進一步做確證實驗。
8 .1．5 確證實驗
典型菌落分別接種到BHIB 肉湯和BHIA 斜面，BHIB 肉湯置35℃士0．5℃ 培養(yǎng)24h 士2h , BHIA 斜面置35℃士0 . 5℃ 培養(yǎng)48h士2h 。
8 .1．5 . 1 BHIB 肉湯培養(yǎng)24h 后，每管肉湯培養(yǎng)物分別接種到相應(yīng)BEA 平板、BHIB 肉湯及含6 . 5 %氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯中。BEA 平板及含6 . 5 ％氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯置35℃士0 . 5℃ 培養(yǎng)48h 士2h ; BHIB 肉湯置45 ℃ 士0 . 5 ℃ 培養(yǎng)48h 士2h ，觀察細菌生長情況。
8 .1．5 . 2 BHIA 斜面培養(yǎng)48h 后，從斜面上挑取菌落作革蘭氏染色。
8 . 1 . 5 . 3 革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌；在BEA 平板上生長并水解七葉苷（形成黑色或棕色沉淀）; BHIB 肉湯中45 ℃ 士0．5 ℃ 生長；并且在含6 . 5 ％氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯中35℃士0 . 5℃生長良好；具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌。
8 .1．6 菌落計數(shù)
對確證為腸球菌的菌落進行平板計數(shù)，生長有30 個~300 個腸球菌為計數(shù)合適范圍。
8.1．7 結(jié)果計算
8 . 1 . 7 . 1 用所選擇計數(shù)的每個平板上典型腸球菌的菌落數(shù)，乘以確認為腸球菌的菌落所占比例，以此求出所選取的同一稀釋度兩個計數(shù)平板的腸球菌菌落數(shù)。
示例：10-1稀釋樣液的兩個平板上分別有85 個和90 個菌落，每個平板所挑取的功個典型菌落中，確認為腸球菌的分別有8 個和9 個，則此稀釋度的兩個計數(shù)平板上腸球菌菌落數(shù)分別是85 x（8 / 10 ）=68 及90x（9 / 10 ）=81 。
8 .1．7 . 2 若只有一個稀釋度平板上的腸球菌菌落數(shù)在計數(shù)合適范圍30 個~300 個之間，則計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值除以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。
8.1．7 . 3 若有兩個連續(xù)稀釋度在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按式（1）計算：
N=∑C/[（n1+0.1n2）d]………………………………………………… （l）
式中：
N ― 樣品中腸球菌菌落數(shù)；
∑C ― 兩個連續(xù)稀釋度平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）腸球菌菌落數(shù)之和
n1 ― 適宜范圍菌落數(shù)的*稀釋度（低）平板個數(shù)；
n2 ― 適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高）平板個數(shù)；
d ― *稀釋度的稀釋倍數(shù)。
示例：
| 稀釋度 | 1:10（*稀釋度） | 1:100（第二稀釋度） |
| 菌落數(shù) | 245,247 | 31,30 |
N=∑C/[（n1+0.1n2）d] =（ 245 + 247 + 31 + 30 ）/[（2 + 0.1x2）x10-1]=2514
上述數(shù)據(jù)經(jīng)修約后，結(jié)果表述為2 .5x103 CFU/g（mL）。
8 . 1 . 7 . 4 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無特征性菌落生長，則以小于l/d（d一zui低稀釋倍數(shù)）計算。
8 . 1 . 7 . 5 低數(shù)值的估算：如果實驗樣品原液（水及液體飲料）或初始稀釋懸液（其他食品）的兩個瓊脂平板上的菌落數(shù)均小于30 個，計算兩個瓊脂平板上菌落數(shù)的算術(shù)平均數(shù)。計算方法見式（2 ） :
NE=∑C /nd…………………………………（ 2 ）
式中：
NE ― 每毫升或每克樣品中腸球菌數(shù)的估算值；
∑C ― 兩個瓊脂平板上腸球菌菌落數(shù)的和；
n― 瓊脂平板的數(shù)量；
d ― 樣品初始懸液或?qū)嶋H接種懸液的稀釋倍數(shù)。
8 . 1 . 7 . 6 大數(shù)值的估算：若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 ，計數(shù)zui接近300 個菌落數(shù)的瓊脂平板上的菌落并計算出算術(shù)平均數(shù)。其他平板可記錄為多不可計。
結(jié)果計算見式（3 ） :
NF=∑C /nd……………………………………………… （3 ）
式中：
NF ― 每毫升或每克樣品中腸球菌菌落數(shù)的估計值；
∑C ― 兩個瓊脂平板上腸球菌菌落數(shù)之和；
n― 瓊脂平板的數(shù)量；
d ― 與樣品懸液相一致的稀釋倍數(shù)。
8 . 1 . 8 結(jié)果表述方式
8 .1．8 . 1 菌落數(shù)在100 以內(nèi)時，按有效數(shù)字修約規(guī)則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。
8 .1．8 . 2 菌落數(shù)大于或等于100 時，前第3 位數(shù)字采用有效數(shù)字修約規(guī)則修約后，取前2 位數(shù)字，后面用。代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10 的指數(shù)形式來表示，此時也按有效數(shù)字修約規(guī)則修約，采用兩位有效數(shù)字。
8 . 1 . 9 結(jié)果報告
固體樣品以CFU/g為單位報告，液體樣品以CFU/ml才為單位報告。
8 . 2 zui近似值（MPN）測定法
8 . 2 . 1 適用范圍
此方法適用于污染程度低的樣品，檢驗含有受損傷的腸球菌的加工食品及腸球菌菌數(shù)小于等于10 CFU/g（ml）的水和食品。
8 . 2 . 2 接種
根據(jù)樣品污染情況，選擇3 個適宜連續(xù)稀釋度的樣液，分別吸取1 mL 稀釋液，接種于*葡萄糖肉湯或腸球菌肉湯，每個稀釋度加3 管。接種量為1 ml 時，使用功ml單料管；對于低污染樣品，將10 mLzui低稀釋度的樣品液加到等體積的雙料培養(yǎng)基中。
8 . 2 . 3 培養(yǎng)
接種后的腸球菌肉湯置35℃士2℃ 培養(yǎng)24h 士2h ，肉湯顏色變?yōu)楹谏脑嚬?，表明有腸球菌生長。一般有腸球菌生長時，肉湯顏色在2h 內(nèi)即可變?yōu)楹谏?br />接種后的*葡萄糖肉湯置36℃士1℃ 培養(yǎng)24h士2h，檢查各試管混濁情況。若無混濁，繼續(xù)培養(yǎng)至48h 士2h 后記錄結(jié)果。
8 . 2 . 4 確證試驗
8 . 2 . 4 . 1 對所有呈現(xiàn)混濁的*葡萄糖肉湯管或顏色變?yōu)楹谏哪c球菌肉湯管進行確證試驗。用接種環(huán)將各管的培養(yǎng)物劃線接種于KF 平板或腸球菌瓊脂平板。KF 平板置36℃士1℃ 培養(yǎng)48h士2h；腸球菌瓊脂平板置35℃士2 ℃ 培養(yǎng)24h 士2h 。
8 . 2 . 4 . 2 腸球菌屬細菌在KF 平板上形成暗紅至粉紅色菌落，邊緣整齊；在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。用滅菌接種針從KF 平板或腸球菌瓊脂平板挑取10 個可疑菌落，按8 . 1 . 5 所述進行確證試驗。
8 . 2 . 5 zui近似值MPN
8 . 2 . 5 . 1 如一管培養(yǎng)物中所挑取的典型菌落中，有一個菌落確認為腸球菌，則該管應(yīng)視為陽性。
8 . 2 . 5 . 2 根據(jù)接種的樣品量和確證為腸球菌的陽性反應(yīng)管數(shù)，查MPN 值表（參見附錄B） ，得出樣品中腸球菌zui近似值。
8 . 2 . 6 結(jié)果報告
腸球菌MPN/g（mL）。
附錄A （資料性附錄）培養(yǎng)基
A . 1 *葡萄糖肉湯
A . 1 . 1 成分
牛肉浸膏 4.5g
胰蛋白脈15.0g
葡萄糖7.5g
氯化鈉7.5g
*0.2g
蒸餾水1000.0mL
A . 1 . 2 制法
將上述各成分混勻，不斷攪拌加熱溶解。每管分裝10 mL , 121 ℃ 高壓滅菌15 min，調(diào)節(jié)pH至7.2。若制備雙料濃度的*葡萄糖肉湯，可將上述配方蒸餾水改為500ml。
A . 2 腸球菌肉湯
A . 2 . 1成分
胰蛋白胨17.0g
牛肉浸膏3.0g
酵母浸膏5.0g
牛膽粉10.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鈉1.0g
七葉苷1.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
*0.25g
蒸餾水1000.0ml
2 制法
將上述各成分加熱煮沸溶解冷卻后，調(diào)pH至7.1 士0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。
A . 3 KF 鏈球菌瓊脂
A . 3 . 1 成分蛋白脈酵母浸膏氯化鈉*麥芽糖乳糖瓊脂
蛋白胨 10.0g
酵母浸膏10.0g
氯化鈉 5.0g
*10.0g
麥芽糖20.0g
乳糖1.0g
*0.4g
瓊脂20.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 3 . 2 制法
將各成分加熱溶解，用10％的碳酸鈉調(diào)整pH 值至7.2,121℃高壓滅菌15 min ，冷卻至50℃ ~ 60℃時加人無菌1 ％氯化三苯四氮唑水溶液10 mL 。
A . 4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）
A . 4 . 1 成分
胰蛋白胨17.0g
牛肉浸膏3.0g
酵母浸膏5.0g
牛膽粉10.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鈉1.0g
七葉苷1.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
*0.25g
瓊脂13.5g
蒸餾水1000.0ml
A . 4 . 2 制法
121 ℃ 高壓滅菌15 min ，滅菌后調(diào)節(jié)pH 至7 . 1 ，于45℃ ~50 ℃ 保溫培養(yǎng)基，從保溫開始至傾注平板的時間不要超過4h 。
A . 5 膽汁七葉苷瓊脂
A . 5 . 1 成分
蛋白胨8.0g
膽鹽20.0g
檸檬酸鐵0.5g
七葉苷1.0g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 5 . 2 制法
將各成分加熱溶解, 121 ℃ 高壓滅菌15 min ，調(diào)節(jié)pH 至7 . 1 士0 . 2 。冷至45 ℃~50 ℃ 傾注平板。
A . 6 腦心浸液肉湯（BHIB）
A . 6 . 1 成分
牛腦浸出粉10.0g
牛心浸出粉9.0g
胰蛋白胨10.0g
葡萄糖2.0g
氯化鈉5.0g
*2.5g
A . 6 . 2 制法
將各成分加人蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH 至7.4士0 .2，分裝，121℃高壓滅菌15min。
A . 7 含6.5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯
A . 7 . 1 成分
除加人氯化鈉（NaCl），其余成分與BHIB相同。
A . 7 . 2 制法
每升BHIB中加60.0g 氯化鈉（NaCl） ，其余制法與BHIB 相同。
A . 8 腦心浸液瓊脂
A . 8 . 1 成分
除每升BHIB 加15.0g瓊脂，其余成分與BHIB 相同。
A . 8 . 2 制法
稱取52g 無水BHIA 溶于1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，每管分裝10mL ,121℃高壓滅菌15min，制備成斜面，調(diào)節(jié)pH至7.4士0.2 。
A . 9 緩沖蛋白胨水
A . 9 . 1 成分
蛋白胨10.0g
氯化鈉5.0g
*9.0g
磷酸二氫鉀1.5g
蒸餾水1000.0ml
A . 9 . 2 制法
按上述成分配好后，調(diào)節(jié)pH 至7.2 ，每瓶分裝225ml , 121℃ 高壓滅菌15min 。
附錄B
（規(guī)范性附錄）
1g樣品中zui近似值（MPN ）表
表B .1 1.0g品中zui近似值（MPN）表
| 陽性管數(shù)／（g/mL ） | MPN | 陽性管數(shù)／（g/mL ） | MPN |
| 0.1 0.01 0.001 | 0.1 0.01 0.001 |
| 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 | <3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 | 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 | 9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 |
| 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 | 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 | 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 | 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 230 290 240 640 1100 >1100 |
| 注：表內(nèi)所列樣品量如改為1g（ml）,0.1g（ml）,0.01g（ml）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改為0.01g（ml）,0.001g（ml）0.0001g（ml）時，則表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)增加10倍，其余可類推。 |
