實驗原理
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death，PCD）是細胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關(guān)。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰*（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或*（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
主要試劑
1. Annexin V-FITC（膜聯(lián)蛋白-V-FITC） 500μl/250μl 20μg/ml
2. 標記緩沖液（Binding Buffer）40/20 ml
3. PBS（1×） 60/30 ml
主要設(shè)備
1. 20μl，200μl，and 1000μl 移液器和吸頭
2. 微量離心管
3. 可調(diào)速離心機
4. 載玻片（用于熒光顯微鏡觀察）
5. 蓋玻片（用于熒光顯微鏡觀察）
6. 去離子水
7. 冰塊
8. 流式細胞儀或熒光顯微鏡
實驗材料
小鼠
實驗步驟
1. 凋亡細胞的制備：小鼠腹腔注射*25mg/kg體重，10h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測細胞的濃度為2 ×106/ml，備用。
2. 200μl細胞懸液加入1ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm 4℃離心10min。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細胞重懸于200μl 標記緩沖液。
5. 加入10μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘或4℃反應(yīng)30分鐘。
6. 加入300μl標記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）檢測。
注意事項
1. 整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。
