1、應(yīng)用范圍
此試劑盒可用于人血漿和尿液中組胺的體外定量檢測(cè)。深化此實(shí)驗(yàn)可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。
2、前言說(shuō)明
組胺（β-咪唑乙胺）是人體中zui重要的介質(zhì)，它主要存在于過(guò)敏反應(yīng)的起始階段（速發(fā)型過(guò)敏）。組胺是由組胺酸經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生的。組胺幾乎存在于機(jī)體的所有組織中，主要儲(chǔ)存于柱狀細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的異染性顆粒中。組胺通常都是以無(wú)活性的復(fù)合體性存在，只有當(dāng)需要的時(shí)候才會(huì)釋放。像其它的介質(zhì)一樣，組胺不僅能調(diào)節(jié)過(guò)敏反應(yīng)的各種臨床癥狀，也可以調(diào)節(jié)終止過(guò)敏反應(yīng)的一系列效應(yīng)。組胺在組織中的生物活性是通過(guò)三種受體來(lái)完成的，它們分別是H1，H2和H3受體。臨床檢測(cè)組胺的方法有：定量檢測(cè)各種速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)中嗜堿性白細(xì)胞釋放組胺的量，也可以檢測(cè)過(guò)敏藥物治療后各種體液（血漿，尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清）中組胺的量。
3、實(shí)驗(yàn)原理
此ELISA試劑盒利用的是競(jìng)爭(zhēng)法的原理。樣品中未知量的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到包被在微孔中的抗體結(jié)合位點(diǎn)上。溫育后洗板以終止競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中抗原的量成反比。樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上直接獲取。
4、儲(chǔ)存與穩(wěn)定性
試劑盒必須在2-8℃的環(huán)境下運(yùn)輸和儲(chǔ)存，避免太陽(yáng)直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。如果將包被板密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下時(shí)，試劑在有效期內(nèi)穩(wěn)定。
5、樣品的采集與儲(chǔ)存
血漿（EDTA，肝素）
按照靜脈穿刺的常規(guī)注意事項(xiàng)采集樣品，血液樣品自采集到實(shí)驗(yàn)時(shí)都必須保證其化學(xué)完整性。不要使用明顯溶血、黃疸和脂血樣品?；鞚岬臉悠窇?yīng)當(dāng)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前離心以除去所有的顆粒性物質(zhì)。 |
儲(chǔ)存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | ≤-70℃ | 避免太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。 |
穩(wěn)定性 | 5小時(shí) | 3個(gè)月 | 2年 |
尿液
實(shí)驗(yàn)必須使用自然產(chǎn)生的尿液，也可使用24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的尿液。收集病人24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的尿液，并混合于含10-15ml 6N HCl防腐劑的容器中。為了計(jì)算結(jié)果，請(qǐng)確定尿液的總體積。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前請(qǐng)先將樣品離心。 |
| 自然的尿液 | 酸化尿液 | | 避免太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。 |
儲(chǔ)存 | 2-8℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ |
穩(wěn)定性 | 8小時(shí) | 3天 | 6個(gè)月 |
細(xì)胞培養(yǎng)上清
使用細(xì)胞培養(yǎng)上清作樣品，一般沒(méi)特殊注意事項(xiàng) 細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的組胺濃度可能稍微要高些。 |
全血
全血中組胺釋放量的檢測(cè)必須用肝素化全血，具體信息請(qǐng)見(jiàn)相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)（RE95000） |
6、試劑盒成分
注意：試劑盒有足夠做96份單孔檢測(cè)或48份雙孔檢測(cè)所需的試劑成分
數(shù)量 | 標(biāo)記 | 成分 |
1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
1×5ml | ANTISERUM | 組胺抗血清，藍(lán)色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的硫柳汞 |
1×75ul | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物，200倍濃縮，內(nèi)含辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的組胺。 |
7×0.4ml | CAL P A-G LYO | 血漿標(biāo)準(zhǔn)品A-G，凍干，用于血漿樣品的定標(biāo)。內(nèi)含：組胺、人血漿。具體濃度請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單。 |
2×0.4ml | CONTROL P1+2 LYO | 血漿質(zhì)控1+2，凍干，內(nèi)含：組胺、人血清。具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽。 |
1×2.0ml 5×0.25ml | CAL U/C A-F | 尿液/細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)品A-F，0;2.7;8.1;24.3;73;219ng/ml,即用，用于尿液和細(xì)胞培養(yǎng)樣品的定標(biāo)。內(nèi)含：組胺和0.1M的HCl。 |
2×0.25ml | CONTROL U/C 1+2 | 尿液質(zhì)控1+2，即用，內(nèi)含：組胺、人尿液（酸化的）。具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽。 |
1×2.25ml | ACYLREAG | ?；噭从?，內(nèi)含：DMF |
1×60ml | ASSAYBUF CONC | 檢測(cè)緩沖液，5倍濃縮，內(nèi)含Tris緩沖液、吐溫、BSA和0.05%的硫柳汞。 |
1×50ml | WASHBUF CONC | 洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。 |
1×10ml | INDICATORBUF | 指示緩沖液，紫色，即用，內(nèi)含：Tris緩沖液、*（pH＜7.5時(shí)顏色會(huì)發(fā)生改變＝和0.1%的硫柳汞。 |
1×12ml | TMB SUBS | TMB底物液，即用，內(nèi)含TMB、緩沖液和穩(wěn)定劑。 |
1×12ml | TMB STOP | TMB終止液，即用，1M的H2SO4。 |
3× | FOIL | 粘性金屬板 |
7、實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供
1）移液器，體積：10;20;50;100;1000ul
2）試管（12×75mm）
3）試管架
4）振蕩器
5）旋渦混合器（500rpm）
6）帶儲(chǔ)器的8道移液器
7）洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機(jī)
8）酶標(biāo)儀（參考波長(zhǎng)：600-650nm）
9）蒸餾水或去離子水
10） 吸水紙、取樣吸頭和計(jì)時(shí)器
8、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說(shuō)明
注意 | 96人份的試劑盒可分成三份分別進(jìn)行檢測(cè)，下述體積為檢測(cè)32人份時(shí)所需要的體積。 |
8.1凍干或濃縮成分的準(zhǔn)備
稀釋/溶解 | 成分 | | 稀釋劑 | 比例 | 備注 | 儲(chǔ)存 | 穩(wěn)定性 |
20ml | 檢測(cè)緩沖液 | 100ml | 蒸餾水 | 1：5 | | 2-8℃ | 2周 |
15ml | 洗滌液 | 300ml | 蒸餾水 | 1：20 | 18-25℃將晶體溶解掉 | 2-8℃ | 4周 |
| 血漿標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.4ml | 蒸餾水 | | 靜置15min,混合時(shí)無(wú)泡沫 | -20℃ | 1個(gè)月 |
| 血漿質(zhì)控品 | 0.4ml | 蒸餾水 | | 靜置15min,混合時(shí)無(wú)泡沫 | -20℃ | 1個(gè)月 |
10ul（*） | 酶聯(lián)物 | 2ml | 檢測(cè)緩 沖液 | 1:200 | 臨時(shí)配置,只能使用一次 | 18-25 ℃ | 30分鐘 |
（*）在稀釋前,確保塞子內(nèi)無(wú)殘留液體.
8.2樣品的稀釋
樣品中組胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的樣品,應(yīng)當(dāng)在?；坝孟鄳?yīng)的稀釋液稀釋,尿液樣品用0.1M的HCl,血漿樣品用樣品稀釋液（Cat.no. KEHP711）,試劑盒內(nèi)未提供。
8.3樣品的?；?/span>
用試管準(zhǔn)備樣品
注意 | 不能血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定酰化尿液或細(xì)胞培養(yǎng)樣品中組胺的濃度,也不能用U/C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定?；獫{樣品中組胺的濃度. |
8.3.1血漿
1 | 將血漿標(biāo)準(zhǔn)品、血漿質(zhì)控品和病人樣品分別100ul加入到相應(yīng)的試管中。 |
2 | 在每一試管中加入100ul指示緩沖液，旋渦混合。 |
3 | 在每一試管中加入20ul?；噭?，加入酰化試劑后立即旋渦混合。 |
4 | 將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。 |
5 | 在每一試管中加入750ul已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。 |
8.3.2尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清
1 | 將U/C標(biāo)準(zhǔn)品、尿液質(zhì)控品和病人尿液或細(xì)胞培養(yǎng)上清分別50ul加入到相應(yīng)的試管中。 |
2 | 在每一試管中加入50ul指示緩沖液，旋渦混合。如果指示劑變成無(wú)色，說(shuō)明溶液的pH值很低，樣品中含有很多酸性物質(zhì)。在這種情況下，再向試管中加入50ul指示緩沖液直至溶液略帶微紅。 |
3 | 在每一試管中加入10ul?；噭尤膈；噭┖罅⒓葱郎u混合。 |
4 | 將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。 |
5 | 在每一試管中加入2000ul已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。 |
注意：酰化處理好的樣品可在2-8℃下存放一晚，-20℃環(huán)境下可存放2天。
9、實(shí)驗(yàn)步驟
1 | 將?；幚磉^(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。 |
2 | 在每一微孔中加入50ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul組胺抗血清。 |
4 | 蓋板，振蕩器（500rpm）上室溫溫育3小時(shí)。 |
5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
6 | 如果有條件的話(huà)，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
7 | 在每一微孔中加入100ul TMB底物液。 |
8 | 血漿：振蕩器（500rpm）上室溫溫育40min。 尿液/細(xì)胞培養(yǎng)上清：振蕩器（500rpm）上室溫溫育20min。 |
9 | 在每一微孔中加入100ul TMB終止液以終止底物反應(yīng)。輕輕振板使溶液混合均勻。 |
10 | 加終止液后15min內(nèi)450nm處讀取OD值。（參考波長(zhǎng)：600-650nm） |
10、期望值
實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作任何治療結(jié)果的*原因，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀(guān)察和診斷檢測(cè)相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍：
血漿 | 尿液 |
| 24小時(shí)尿液 | 自然產(chǎn)生的尿液 |
ng/ml | ug/d | ug/g肌酐酸 |
0.2-1.0 | 5-56 | 8-53 |
會(huì)員1.png)