前言簡(jiǎn)介
細(xì)胞因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子1（CINC-1）zui初是通過白介素1β刺激大鼠腎上皮細(xì)胞（NRK-52E）純化提取的.1989年時(shí),富山醫(yī)科藥科大學(xué)的Watanabe團(tuán)隊(duì)鑒別出了大鼠CINC-1的氨基酸序列.CINC-1是CXC趨化因子亞族的一員.另外其它幾種大鼠CXC趨化因子（CINC-2α, CINC-2β, CINC-3/MIP-2）的序列也被鑒別出來,大約有63 - 67%的氨基酸序列與CINC-1的相同.此外, GROα, GROβ與GROγ也分別有68%, 71%,69%與CINC-1序列一致.這表明CINCs是人GROs的大鼠相似物.
原理
此試劑盒運(yùn)用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強(qiáng)度與樣品中大鼠GRO/CINC-1的量成正比.
檢測(cè)范圍
4.69 ~ 300 pg/mL
預(yù)期用途
■此IBL試劑盒能用于大鼠血清,EDTA血漿,細(xì)胞上清中GRO/CINC-1的定量檢測(cè)
■重組和天然的大鼠GRO/CINC-1都可以檢測(cè).
試劑盒成分
1 預(yù)包被板: 抗大鼠GRO/CINC-1兔子IgG,親合純化 96T
2 酶標(biāo)記抗體:
（30倍濃縮）HRP標(biāo)記抗大鼠GRO/CINC-1兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
3 標(biāo)準(zhǔn)品: 重組大鼠GRO/CINC-1 0.5mL x 2
4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
5 標(biāo)記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 濃縮洗滌液:
（40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1
操作說明
1實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒沒有提供）
酶標(biāo)儀（450nm） 微移液管及其吸嘴
量筒及燒杯 蒸餾水
冰箱（4°C） 坐標(biāo)紙（log/log）
吸水紙 試管（用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋）
溫育箱（37°C ± 1°C）
洗瓶（用于洗板）
一次性試劑管（用于濃縮酶標(biāo)記抗體和顯色劑）
2準(zhǔn)備
- 洗滌液的準(zhǔn)備
試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL蒸餾水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.
- 酶標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備
試劑盒中的標(biāo)記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板（8孔）,就需800 μL.的標(biāo)記抗體.就用870 μL的標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30 μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標(biāo)記抗體需稀釋后才能用于實(shí)驗(yàn)剩余的稀釋標(biāo)記抗體液需密封瓶裝,存于4°C
- 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
加0.5 mL的蒸餾水到瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品,制成濃度為600 pg/mL大鼠GRO/CINC-1標(biāo)準(zhǔn)品液
- 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋
準(zhǔn)備8支試管,
并每支各加230 μL EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1 300 pg/mL
試管2 150 pg/mL
試管3 75 pg/ mL
試管4 37.5 pg/mL
試管5 18.75 pg/mL
試管6 9.38 pg/mL
試管7 4.69pg/mL
試管8 0 pg/mL（樣品空白對(duì)照）
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品液于1號(hào)管混勻，然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管混勻，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋，第8號(hào)管為0 pg/mL作為樣品空白對(duì)照
- 樣品稀釋
樣品如需稀釋時(shí),必須用EIA緩沖液進(jìn)行稀釋
如果樣品中大鼠GRO/CINC-1的濃度范圍一無所知的話,預(yù)先準(zhǔn)備幾個(gè)不同稀釋梯度的樣品液來確定*的檢測(cè)濃度.
3實(shí)驗(yàn)步驟使用前，將所有試劑應(yīng)平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無改變，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測(cè)必須同時(shí)進(jìn)行.
| 試劑 | 待檢測(cè)樣品 | 標(biāo)準(zhǔn)品 | 樣品空白 | 試劑空白 |
| 檢測(cè)樣品100ul | 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1-7管）100ul | EIA緩沖液（第8管）100ul | EIA緩沖液100ul |
| 蓋板，于37°C下溫育1小時(shí) |
| 洗板7次 |
| 酶標(biāo)抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
| 蓋板，于37°C下溫育30min |
| 洗板9次 |
| 顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 室溫避光溫育30min |
| 終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值 |
1）設(shè)試劑空白對(duì)照，并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2） 確定好樣品空白對(duì)照孔，檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，分別將100ul樣品對(duì)照品（8號(hào)管）、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品（1-7號(hào)管）加入到相應(yīng)的微孔中。
3）蓋板，37°C下溫育1小時(shí)
4）用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應(yīng)液
重復(fù)洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動(dòng)洗板機(jī)洗板,先自動(dòng)洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次5）除試劑空白對(duì)照孔外,其余每孔各加100ul酶標(biāo)抗體
6）蓋板，37°C下溫育30min
7）按照上述步驟4）洗板9次
8） 用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色
10）每孔各加100ul終止液，溶液顏色會(huì)變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內(nèi)溶液無氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標(biāo)儀450nm處讀取結(jié)果
特別注意
- 收集樣品后即盡快檢測(cè). 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復(fù)凍融.檢測(cè)前,將樣品解凍至室溫.
- 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
- 建議樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做雙份檢測(cè)
- 保持樣品處于中性PH范圍.有機(jī)溶劑的污染會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
- 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果
- 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時(shí),切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
- 顯示劑應(yīng)避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
- 加終止液后,30 min內(nèi)就應(yīng)讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果計(jì)算所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（包括標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)樣品的OD值）,都應(yīng)減去樣品空白對(duì)照的OD值.
在log-log坐標(biāo)紙用,以較正的OD值為縱坐標(biāo),相對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線. 樣品直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取濃度值.
標(biāo)準(zhǔn)曲線示范
上圖所示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線僅用于演示示范,不能用于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取.每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線.
常規(guī)事項(xiàng)1所有試劑置于2 - 8°C保存.實(shí)驗(yàn)前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強(qiáng)酸物質(zhì).使用時(shí),避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標(biāo)抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會(huì)出現(xiàn)沉淀,但這并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)
6使用試劑后應(yīng)洗手
7切勿混用不同批號(hào)的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
存儲(chǔ)與有效期存儲(chǔ)條件:2 - 8°C
有效期見試劑盒外包裝
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