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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：533發(fā)布時(shí)間：2012-2-27
用途：
單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）又稱單核細(xì)胞趨化和激活因子（monoctye chemotactic and activating factor,MCAF），屬于C-C亞族（β亞族）成員。MCP-1/MCAF起初是從人髓樣單核細(xì)胞系THP-1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及LPS或PHA刺激的人PBMC培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)。目前已知，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等在PHA、LPS、Poly I-C、IL-1、IFN-γ、PDGF、EGF或某些病毒刺激下均可被誘導(dǎo)分泌MCP-1。某些腫瘤細(xì)胞系則可組成性產(chǎn)MCP-1。
人MCP-1/MCAF基因定位于第17對(duì)染色體。人MCP-1前體長99個(gè)氨基酸，切除23個(gè)氨基酸先導(dǎo)序列后形成76氨基酸的成熟分子，為堿性蛋白。非糖基化的MCP-1分子量8.7kDa，經(jīng)不同糖基化后MCP-1分子量有13kDa兩種。MCP-1分子中11與36Cys和12與52Cys之間所形成兩個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵以及Try28和Arg30，對(duì)于MCP-1的生物學(xué)活性是必需的。在氨基酸水平上，MCP-1與另外兩種單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-2（HC14）和MCP-3（NC28）分別有62%和72%同源性，與C-X-C亞族中IL-8有24%同源性。
體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了MCP-1對(duì)單核細(xì)胞具有趨化活性，激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，超氧陰離子的產(chǎn)生和釋放，并釋放*，上調(diào)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞粘附分子如integrin家族β2組和α4分子的表達(dá)和細(xì)胞因子IL-1、IL-6的產(chǎn)生，活化的巨噬細(xì)胞可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。MCP是嗜堿性粒細(xì)胞的趨化劑和激活劑，尤其是刺激嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒和組胺釋放的作用較為強(qiáng)烈。MCP-1與MCP-1R發(fā)生特異性的結(jié)合，此受體主要分布于單核細(xì)胞、髓樣前體細(xì)胞系和嗜堿性粒細(xì)胞，屬于IL-8R家族。分布于人紅細(xì)胞表面的Duffy抗原也可結(jié)合MCP-1。
風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑液和血清中MCP-1水平明顯升高，滑液組織巨噬細(xì)胞組成性地產(chǎn)生MCP-1，提示MCP-1與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理損傷有關(guān)。高*血癥時(shí)，動(dòng)脈內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生高水平MCP-1，單核細(xì)胞粘附于血管壁并浸潤動(dòng)脈壁。腎臟炎癥時(shí)，IL-1誘導(dǎo)腎小球細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1。高血脂癥時(shí)，LDL與腎小球細(xì)胞結(jié)合，刺激其產(chǎn)生MCP-1，趨化單核細(xì)胞在局部浸潤。
本試劑盒用于定量檢測兔血清中的MCP-1的濃度。
原理：
本試劑盒采用雙抗夾心ELISA法。抗兔MCP-1單抗包被于酶標(biāo)板上，兔標(biāo)本中的MCP-1會(huì)與單抗結(jié)合。加入*化的抗兔MCP-1（二抗），它將與結(jié)合在單抗上的兔MCP-1結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，未結(jié)合的將被洗去。辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin 將與二抗的*結(jié)合，多余的物質(zhì)會(huì)被洗掉。加入TMB顯色。兔MCP-1的濃度與OD（450nm）成正比。
試劑盒組成：
酶標(biāo)板（Coated Wells） 48wells Anti-rabbit MCP-1 Biotin 1 vial
濃縮洗滌液（100X）（Washing Concentrate） 5ml 標(biāo)準(zhǔn)品（Standards） 1 vial
顯色液（TMB Substrate） 6ml 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（Standard Diluent） 7ml
終止液（Stop Solution） 5ml 濃縮酶聯(lián)物（HRP） 1 vial
酶聯(lián)物稀釋液（HRP Diluent） 7ml *稀釋液（Biotin anti MCP-1 Diluent） 7ml
需要但未提供的材料
可在450nm處進(jìn)行讀數(shù)的酶標(biāo)儀；
能吸取10-200µL的移液器；
可調(diào)多道（8）移液器（50－200µL）；
供可調(diào)多道移液器使用的試劑存放槽；
洗瓶或洗板機(jī)；
蒸餾水或去離子水；
1升的圓柱形量筒；
血清移液器：1和（10或25 mL）；
移液器槍頭；
紙巾；
計(jì)時(shí)器，用以監(jiān)控溫育步驟；
處理池和消毒劑（例如：0.5% 次氯酸鈉, 10% 家用漂白水）；
注意事項(xiàng):
嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入HRP或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
不能使用過期產(chǎn)品。
如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
保存：
貯藏于2-8°C。
樣品：
在此檢測中，可使用血清樣品。
準(zhǔn)備工作：
濃縮洗滌液（100X）用雙蒸水稀釋成1X（至500ml）。
標(biāo)準(zhǔn)品用1ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶。得到1500pg/ml的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品。高濃度標(biāo)準(zhǔn)品可保存于-20°C。
將1500pg/ml的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一組標(biāo)準(zhǔn)品，如： 750, 375, 187.5, 93.75, 46.875, 23.4, 11.7, 0pg/ml。
配制1x HRP：一支 HRP加入6 ml 酶聯(lián)物稀釋液，混勻。1x HRP在臨用前15分鐘配制。
配制1x Biotin：一支Biotin anti rabbit MCP-1加入6 ml Biotin稀釋液，混勻。1x Biotin在臨用前15分鐘配制。
操作步驟：
試劑盒應(yīng)平衡至室溫（20-25°C ）再試驗(yàn)。 取出所需反應(yīng)板。
臨用前15分鐘配制工作液
加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）、100ul標(biāo)本于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。
輕輕混勻30秒，封住板孔，37°C溫育 60分鐘。
洗板：甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350ul洗滌液），并去除水滴（在厚疊吸水紙上拍干）；反復(fù)洗滌5次。
每孔加入100ul 1x Biotin。輕輕混勻30秒，封住板孔，37°C溫育 60分鐘
洗板：甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350ul洗滌液），并去除水滴（在厚疊吸水紙上拍干）；反復(fù)洗滌5次。
每孔加入100ul 1x HRP。輕輕混勻30秒，封住板孔，37°C溫育 30分鐘
洗板：甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350ul洗滌液），并去除水滴（在厚疊吸水紙上拍干）；反復(fù)洗滌5次。
每孔加入100ul TMB顯色液， 輕輕混勻10秒，37°C暗處溫育15±10分鐘。
每孔加入100ul終止液（Stop Solution）。輕輕混勻30秒；30分鐘內(nèi)在450nm處讀OD值。
以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。
注意事項(xiàng)：
作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底；如果標(biāo)本用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，也要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底，如果標(biāo)本未用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，標(biāo)本不需扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底。
*（Biotin anti rabbit MCP-1） 和濃縮酶聯(lián)物（HRP）用前應(yīng)離心，使液體位于管底。
主營產(chǎn)品：ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，豚鼠ELISA試劑盒，兔ELISA試劑盒，羊ELISA試劑盒，牛ELISA試劑盒，雞ELISA試劑盒，鴨ELISA試劑盒，植物ELISA試劑盒
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