植物幾丁質(zhì)酶(chitinase)ELISA試劑盒中內(nèi)容(96孔)
1． 重組人VEGF凍干標準品，10ng/管，總2管。
2． 預(yù)包被抗人VEGF抗體的96孔板。
3． 樣品稀釋液，30ml。
4． *標記抗人VEGF，120μl，效價1：100。
5． 抗體稀釋液，12ml。
6． 親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC），120μl，效價1：100。
7． ABC稀釋液，12ml。
8． TMB顯色液，10ml。
9． TMB終止液，10ml。
植物幾丁質(zhì)酶(chitinase)ELISA試劑盒需要而未提供的試劑和器材
1． 標準規(guī)格酶標儀。
2． 自動洗板機。
3． 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器。
4． 干凈的試管和Eppendof管。
5． 使用中性PBS或TBS作為洗滌液。0.01M TBS配法為：1000ml H2O中加Tris 1.2g, NaCl 8.5g; 純乙酸450μl或濃鹽酸700μl左右調(diào)節(jié)pH值(7.2-7.6)。 0.01 M PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml蒸餾水中加氯化鈉8.5g, Na2HPO4·12H2O 3.5g, NaH2PO4·2H2O 0.25g。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將*的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
植物幾丁質(zhì)酶(chitinase)ELISA試劑盒操作程序
所有試劑用前需在室溫平衡。試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如果估計樣品VEGF濃度＞2000pg/ml時，應(yīng)在試管中將樣品用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目，并增加1孔作為TMB空白顯色孔。總數(shù)=樣品數(shù)+9；做雙份檢測時×2。其余重包裝好放如冰箱中。
2． 將1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于人血清、體液、組織勻漿或細胞培養(yǎng)上清，每孔先加50μι樣品稀釋液，再加50μι樣品。
3． 酶標板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。
4． 反應(yīng)后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體（將自動洗板機的洗滌次數(shù)設(shè)為零再開始即可）；或甩去酶標板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下。不洗。
5． 將準備好的*抗人VEGF抗體工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白顯色孔除外）。37℃反應(yīng)60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。吸去或甩去多余液體。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白顯色孔除外）。37℃反應(yīng)30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。吸去或甩去多余液體。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)20-25分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯）。
10． 按每孔0.1ml依次加入TMB終止液，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。
11． 用酶標儀在450nm測定O.D.值，將TMB空白顯色孔設(shè)為對照。
12． 所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。
13． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算(下載)。應(yīng)記住由于樣品稀釋了1倍，其實際濃度應(yīng)該×2。
植物幾丁質(zhì)酶(chitinase)ELISA試劑盒操作程序總結(jié)：
1． 加樣品和標準品，37℃反應(yīng)120分鐘。不洗。
2． 加*標記抗體，37℃反應(yīng)60分鐘。0.01M TBS洗滌3次。
3． 加ABC，37℃反應(yīng)30分鐘。0.01M TBS洗滌5次。
4． TMB37℃反應(yīng)20-25分鐘。
5． 加入TMB終止液，讀數(shù)。
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