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上海哈靈生物科技有限公司
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組織蛋白激酶A(PKA)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書
2021-8-5 閱讀(1423)
組織蛋白激酶A(PKA)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書
主要用途
組織蛋白激酶A(PKA)活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過多肽底物受到PKA磷酸化后,進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng),測(cè)定產(chǎn)生ADP過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應(yīng), 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化,以分析組織裂解樣品中PKA活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、部分或*純化酶樣品中PKA激酶的定量檢測(cè),以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,高度敏感。
技術(shù)背景
蛋白激酶A(protein kinase A;PKA),又稱cAMP依賴性蛋白激酶(cAMP dependent protein kinase),是第二信使依賴性酶。通過影響腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase;AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase)的活性,而決定cAMP水平,達(dá)到調(diào)節(jié)PKA活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于各種外部刺激的反應(yīng),包括細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排等。該全酶(holoenzyme)具有兩個(gè)催化亞體和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞體構(gòu)成的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。cAMP結(jié)合調(diào)節(jié)亞體,而釋放出活化的催化亞體,產(chǎn)生目標(biāo)蛋白上絲/蘇氨酸(serine/threonine)的磷酸化,諸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受體等,而調(diào)控一系列細(xì)胞活動(dòng)。其磷酸化目標(biāo)序列為Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有兩個(gè)亞酶:I型亞酶存在于胞漿內(nèi),而二型亞酶與細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞骨架相關(guān)?;诘孜風(fēng)RRASLG,在ATP的存在下,受到PKA激酶的磷酸化,獲得產(chǎn)物磷酸化多肽,進(jìn)而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應(yīng)系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的變化(340nm),來(lái)定量分析蛋白激酶A的活性。其反應(yīng)方式為:
PKA
LRRASLG + ATP → LRRApSLG + ADP
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
(高吸收峰)(低吸收峰)
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 60毫升
裂解液(Reagent B) 10毫升
緩沖液(Reagent C) 4毫升
酶促液(Reagent D) 500微升
反應(yīng)液(Reagent E) 500微升
底物液(Reagent F) 500微升
陰性液(Reagent G) 500微升
產(chǎn)品說(shuō)明書 1份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6月
用戶自備
PKA激酶:用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器
(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)胞預(yù)處理
200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于樣品光度分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、待測(cè)樣品準(zhǔn)備
1.手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重500毫克組織重量
2.(選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3.(選擇步驟)加入3毫升清理液(Reagent A)清洗
4.(選擇步驟)抽去清理液
5.移入到一個(gè)液氮凍存管
6.即刻放進(jìn)液氮罐過夜
7.次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融)
8.放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
9.加入置于冰槽里的100至500微升裂解液(Reagent B)(注意:可以調(diào)節(jié)蛋白濃度)
10.強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,充分混勻
11.放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時(shí)停止,放進(jìn)-70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>
12.即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為10000g
13.小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
14.移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1)
15.放進(jìn)-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1.準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如組織裂解懸液等),置于冰槽里
2.設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長(zhǎng)為340nm,間隔1分鐘,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零
3.緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
三、背景對(duì)照測(cè)定
1.移取130微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2.加入20微升酶促液(Reagent D)
3.加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)
4.加入20微升底物液(Reagent F)
5.放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6.加入10微升陰性液(Reagent G)
7.上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
8.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照:340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 -340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
四、樣品測(cè)定
1.移取130微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2.加入20微升酶促液(Reagent D)
3.加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)
4.加入20微升底物液(Reagent F)
5.放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6.加入10微升待測(cè)樣品(注意:50微克組織裂解蛋白;樣品須溶解)
7.上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
8.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品總活性讀數(shù):340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 -340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
五、計(jì)算樣品活性
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 0.1(體系容量;毫升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 5(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾NADH/分鐘
六、酶標(biāo)板測(cè)定
1.在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
2.分別移取130微升緩沖液(Reagent C)到96孔板中
3.分別加入20微升酶促液(Reagent D)
4.分別加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)
5.分別加入20微升底物液(Reagent F)
6.輕輕搖動(dòng)96孔板
7.在30℃溫度下孵育3分鐘
8.分別加入10微升陰性液(Reagent G)或待測(cè)樣品(50微克組織裂解懸液蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈)
9.輕輕搖動(dòng)96孔板
10.即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
11.活性計(jì)算:
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.1(體系容量;毫升)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 5(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾NADH/分鐘
七、抑制劑篩選
1.在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景、*活性和待測(cè)抑制劑樣品
2.按下表加入試劑,進(jìn)行樣品預(yù)處理
內(nèi)容物空背景對(duì)照樣本背景*酶活性待測(cè)抑制劑酶活性
緩沖液(Reagent C)20微升20微升20微升20微升
陰性液(Reagent G)20微升10微升10微升——
待測(cè)抑制劑——10微升――10微升
用戶自備的純化酶————10微升(1毫單位)10微升(1毫單位)
96孔板每孔總量空背景對(duì)照孔
(40微升)樣本背景孔
(40微升)*活性孔
(40微升)待測(cè)抑制劑樣品孔
(40微升)
輕輕搖動(dòng)96孔板,混勻,放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作
3.分別移取100微升緩沖液(Reagent C)到新的96孔板的所有孔里
4.分別加入20微升酶促液(Reagent D)
5.分別加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)
6.分別加入20微升底物液(Reagent F)
7.輕輕搖動(dòng)96孔板
8.在30℃溫度下孵育3分鐘
9.加入40微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
10.即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè):測(cè)讀30分鐘
11.抑制活性計(jì)算:
1)[(*活性讀數(shù)-空背景對(duì)照讀數(shù))-(抑制劑樣品活性讀數(shù)-樣本背景讀數(shù))]÷(*活性讀數(shù)-空背景對(duì)照讀數(shù))=實(shí)際抑制百分率
2)IC50:50%抑制率所需的抑制劑濃度
X(所需抑制劑樣品濃度)=(已知抑制劑樣品濃度÷實(shí)際抑制百分率)X 50%
3)直接構(gòu)建抑制曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為吸光單位(OD);橫座標(biāo)(X軸)為已知抑制劑濃度
注意事項(xiàng)
1.本產(chǎn)品為25次操作,包括背景操作
2.操作時(shí),須戴手套
3.系統(tǒng)操作過程中,背景測(cè)定只需1次
4.樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
5.樣品須澄清,至關(guān)重要
6.建議使用比色皿測(cè)定
7.加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定
8.測(cè)定值由高到低變化;測(cè)定可持續(xù)30分鐘
9.光度測(cè)定后,比色皿須清洗*
10.樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
11.樣本測(cè)定讀數(shù)持續(xù)上升,表明酶活過低或樣品量過低
12.建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升(本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1)
13.如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
14.可以使用蛋白激酶A抑制劑(PKA-PKI)作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
15.蛋白激酶A活性單位濃度定義:在30℃溫度下,pH 7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個(gè)活性單位
16.本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感