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上海哈靈生物科技有限公司

主營(yíng)產(chǎn)品: ELISA代測(cè)服務(wù),ELISA試劑盒價(jià)格,ELISA試劑盒,ELISA試劑盒說(shuō)明書,大鼠ELISA試劑盒

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組織蛋白激酶A(PKA)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

2021-8-5  閱讀(1423)


組織蛋白激酶A(PKA)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書


主要用途


組織蛋白激酶A(PKA)活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過多肽底物受到PKA磷酸化后,進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng),測(cè)定產(chǎn)生ADP過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應(yīng), 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化,以分析組織裂解樣品中PKA活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、部分或*純化酶樣品中PKA激酶的定量檢測(cè),以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,高度敏感。


技術(shù)背景


蛋白激酶A(protein kinase A;PKA),又稱cAMP依賴性蛋白激酶(cAMP dependent protein kinase),是第二信使依賴性酶。通過影響腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase;AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase)的活性,而決定cAMP水平,達(dá)到調(diào)節(jié)PKA活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于各種外部刺激的反應(yīng),包括細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排等。該全酶(holoenzyme)具有兩個(gè)催化亞體和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞體構(gòu)成的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。cAMP結(jié)合調(diào)節(jié)亞體,而釋放出活化的催化亞體,產(chǎn)生目標(biāo)蛋白上絲/蘇氨酸(serine/threonine)的磷酸化,諸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受體等,而調(diào)控一系列細(xì)胞活動(dòng)。其磷酸化目標(biāo)序列為Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有兩個(gè)亞酶:I型亞酶存在于胞漿內(nèi),而二型亞酶與細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞骨架相關(guān)?;诘孜風(fēng)RRASLG,在ATP的存在下,受到PKA激酶的磷酸化,獲得產(chǎn)物磷酸化多肽,進(jìn)而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應(yīng)系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的變化(340nm),來(lái)定量分析蛋白激酶A的活性。其反應(yīng)方式為:

PKA

LRRASLG  +  ATP  →  LRRApSLG  +  ADP


pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

        

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD+

          (高吸收峰)(低吸收峰) 


產(chǎn)品內(nèi)容


清理液(Reagent A)            60毫升

裂解液(Reagent B)            10毫升

緩沖液(Reagent C)            4毫升

酶促液(Reagent D)          500微升

反應(yīng)液(Reagent E)          500微升

底物液(Reagent F)           500微升

陰性液(Reagent G)          500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書     1份


保存方式


保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6月


用戶自備


PKA激酶:用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)胞預(yù)處理

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于樣品光度分析


實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、待測(cè)樣品準(zhǔn)備


1.手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重500毫克組織重量 

2.(選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3.(選擇步驟)加入3毫升清理液(Reagent A)清洗

4.(選擇步驟)抽去清理液

5.移入到一個(gè)液氮凍存管

6.即刻放進(jìn)液氮罐過夜

7.次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融)

8.放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

9.加入置于冰槽里的100至500微升裂解液(Reagent B)(注意:可以調(diào)節(jié)蛋白濃度) 

10.強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,充分混勻

11.放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時(shí)停止,放進(jìn)-70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>

12.即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為10000g 

13.小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管

14.移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1)

15.放進(jìn)-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用


二、測(cè)定準(zhǔn)備


1.準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如組織裂解懸液等),置于冰槽里 

2.設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長(zhǎng)為340nm,間隔1分鐘,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零

3.緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度


三、背景對(duì)照測(cè)定


1.移取130微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿

2.加入20微升酶促液(Reagent D)

3.加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)

4.加入20微升底物液(Reagent F)

5.放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6.加入10微升陰性液(Reagent G)

7.上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))

8.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照:340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 -340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘


四、樣品測(cè)定


1.移取130微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿

2.加入20微升酶促液(Reagent D)

3.加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)

4.加入20微升底物液(Reagent F)

5.放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6.加入10微升待測(cè)樣品(注意:50微克組織裂解蛋白;樣品須溶解)

7.上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))

8.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品總活性讀數(shù):340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 -340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

 

五、計(jì)算樣品活性

 

[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 0.1(體系容量;毫升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 5(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克

 

單位=微摩爾NADH/分鐘


六、酶標(biāo)板測(cè)定


1.在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品

2.分別移取130微升緩沖液(Reagent C)到96孔板中

3.分別加入20微升酶促液(Reagent D)

4.分別加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)

5.分別加入20微升底物液(Reagent F)

6.輕輕搖動(dòng)96孔板

7.在30℃溫度下孵育3分鐘

8.分別加入10微升陰性液(Reagent G)或待測(cè)樣品(50微克組織裂解懸液蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈)

9.輕輕搖動(dòng)96孔板

10.即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11.活性計(jì)算:


[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.1(體系容量;毫升)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 5(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克


單位=微摩爾NADH/分鐘


七、抑制劑篩選


1.在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景、*活性和待測(cè)抑制劑樣品

2.按下表加入試劑,進(jìn)行樣品預(yù)處理


內(nèi)容物空背景對(duì)照樣本背景*酶活性待測(cè)抑制劑酶活性

緩沖液(Reagent C)20微升20微升20微升20微升

陰性液(Reagent G)20微升10微升10微升——

待測(cè)抑制劑——10微升――10微升

用戶自備的純化酶————10微升(1毫單位)10微升(1毫單位)

96孔板每孔總量空背景對(duì)照孔

(40微升)樣本背景孔

(40微升)*活性孔

(40微升)待測(cè)抑制劑樣品孔

(40微升)

輕輕搖動(dòng)96孔板,混勻,放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作


3.分別移取100微升緩沖液(Reagent C)到新的96孔板的所有孔里

4.分別加入20微升酶促液(Reagent D)

5.分別加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)

6.分別加入20微升底物液(Reagent F) 

7.輕輕搖動(dòng)96孔板

8.在30℃溫度下孵育3分鐘

9.加入40微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

10.即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè):測(cè)讀30分鐘

11.抑制活性計(jì)算:

1)[(*活性讀數(shù)-空背景對(duì)照讀數(shù))-(抑制劑樣品活性讀數(shù)-樣本背景讀數(shù))]÷(*活性讀數(shù)-空背景對(duì)照讀數(shù))=實(shí)際抑制百分率

2)IC50:50%抑制率所需的抑制劑濃度

X(所需抑制劑樣品濃度)=(已知抑制劑樣品濃度÷實(shí)際抑制百分率)X 50%

3)直接構(gòu)建抑制曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為吸光單位(OD);橫座標(biāo)(X軸)為已知抑制劑濃度


注意事項(xiàng)


1.本產(chǎn)品為25次操作,包括背景操作

2.操作時(shí),須戴手套

3.系統(tǒng)操作過程中,背景測(cè)定只需1次

4.樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 

5.樣品須澄清,至關(guān)重要 

6.建議使用比色皿測(cè)定

7.加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定

8.測(cè)定值由高到低變化;測(cè)定可持續(xù)30分鐘

9.光度測(cè)定后,比色皿須清洗*

10.樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11.樣本測(cè)定讀數(shù)持續(xù)上升,表明酶活過低或樣品量過低

12.建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升(本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1) 

13.如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度

14.可以使用蛋白激酶A抑制劑(PKA-PKI)作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

15.蛋白激酶A活性單位濃度定義:在30℃溫度下,pH 7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個(gè)活性單位

16.本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)


1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感




產(chǎn)品對(duì)比 二維碼

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