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標記抗體的原理：
目前較為常用的標記抗體的方法，FITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結晶，性質穩(wěn)定在低溫中能保存數年。在堿性條件下，FITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價結合，形成FITC-蛋白質結合物，即熒光抗體或熒光結合物。一個抗體分子上最多能標記15~20個FITC分子，被標記的抗體仍能保持與相應抗原結合的能力，在熒光燈源紫外線或藍紫光激發(fā)下產生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡進行觀察或利用流式細胞儀分析，從而對抗原進行定性、定位或定量。 

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抗體的種類：
抗體是在抗原刺激下產生的，體液性抗體由B淋巴細胞系產生。根據其化學結構和抗原的不同可分為IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD5種類型.目前對免疫球蛋白G、A、M、E了解較多，對D的功能了解較少。
（1） IgG：是血清中濃度的一類球蛋白，約占免疫球蛋白含量的70～80%，50%分布于血漿。機體受到抗原初次刺激后，其產生時間僅次于IgM。在抗體介導的抗感染免疫中起主要作用。IgG是球蛋白單體，分子量16萬～18萬，可以通過兔的胎盤，但不能通過豬和牛的胎盤。在體內可以有效地抵抗細菌、病毒等微生物侵襲。在體外的血清學反應中，參與沉淀反應、凝集反應、補體結合反應和中和反應。
（2） IgM：由5個球蛋白單位組成的五聚體，在血清中的含量僅次于IgG，分子量90萬，是體內的球蛋白?？乖醮未碳C體后，IgM出現最早,在血清中的含量僅次于IgG，主要分布在血管內，可以通過激活補體發(fā)揮溶菌、溶細胞及中和病毒的作用。因其是五聚體，免疫作用很強，是IgG的100倍，但由于含量僅為IgG的1/10，且持續(xù)時間短，所以在抗感染免疫中不能起主要作用。在體外的血清學反應中，參與凝集反應和補體結合反應。
（3） IgA：有單體和雙體兩種形式。單體存在于血清中，分子量約為17萬，亦稱為血清型IgA，有抗菌和抗病毒作用。雙體主要存在于外分泌液中，如唾液、淚液、初乳、氣管分泌液，以初乳中的含量。雙體IgA亦稱為分泌型IgA，由存在于粘膜和組織上的漿細胞產生，分子量40萬，含量較單體高6～８倍，是粘膜的重要防御因素，可以阻止細菌或病毒吸附于粘膜表面。
（4） IgE：是一種特殊的糖蛋白，為單位體結構，分子量19萬，由消化道、呼吸道粘膜固有層及局部淋巴結中的漿細胞所形成，在血清中含量甚微，是一種致敏抗體，容易吸附在細菌表面，當與相應抗原結合所引起過敏反應。在機體抵抗細菌和病毒的感染中幾乎無作用。多克隆抗體制備過程：
蛋白抗原
               ↘抗原準備→兔、小鼠免疫→抗血清→抗體純化  →鑒定（ELISA、WB、IHC）
多肽偶聯(lián)  ↗                                                 （抗原親和純化）
從細胞中提取出來的生物大分子是不純凈的，必須進一步分離純化才能獲得純品。在生物大分子制備工作中，分離純化是比較復雜和重要的一個環(huán)節(jié)。對于異類的物質，如提純蛋白質和酶時混雜著核酸，提純核酸時混雜著蛋白質或多糖，一般可用專一性酶水解、有機溶劑抽提、選擇性分部沉淀等方法處理，小分子物質常在整個制備過程中多次液相與固相互相轉化被分離或用透析方法除去。而對同類物質，如酶和雜蛋白，RNA和DNA以及不同結構的蛋白質、酶、核酸之間的分離，情況則復雜得多，主要應用的方法有電泳法、超速離心法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、吸附法、結晶法、電點沉淀法、柱層析法
抗原抗體反應影響因素：
（一）反應物自身的因素
5） 抗體：不同來源的抗體,反應性各有差異,抗體的濃度、特異性和親和力都影響抗體抗原反應,為提高試驗的可靠性,應選擇高特異性、高親和力的抗體作診斷試劑.等價帶的寬窄也影響抗原抗體復合物的形成,單克隆抗體不適用于沉淀反應.
6）  抗原：抗原的理化性狀、分子量、抗原決定簇的種類及數目均可影響反應結果.顆粒性抗原出現凝集反應,可溶性抗原出現沉淀反應,單價抗原與相應抗體結合不出現沉淀現象.
（二）反應環(huán)境條件
7） 酸堿度：抗原抗體反應必須在合適的pH環(huán)境中進行.蛋白質具有兩性電離性質,因此每種蛋白質都有固定的等電點.抗原抗體反應一般在pH6～9進行,有補體參與的反應pH為7.7.4,pH過高或過低都將影響抗原與抗體反應.
8）  溫度：在一定范圍內,溫度升高可加速分子運動,抗原與抗體碰撞機會增多,使反應加速.一般為15℃～40℃,常用的抗原抗體反應溫度為37℃,溫度如高于56℃,可導致已結合的抗原抗體再解離,甚至變性或破壞.每種試驗都有其*的最適反應溫度要求.此外,適當振蕩也可促進抗原抗體分子的接觸,加速反應.
9）  電解質：抗原與抗體發(fā)生特異性結合后,雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體,若溶液中無電解質參加,仍不出現可見反應.為了促成沉淀物或凝集物的形成,常用0.85%NaCl或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液

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