Invitrogen T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒
mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒設(shè)計用于體外合成大量的加帽 RNA。加帽 RNA 可模擬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)真核 mRNA，因為其在 5' 末端有一個 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)。mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒反應(yīng)包括超高得率轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的帽類似物 [m7G(5')ppp(5')G]。帽類似物僅作為轉(zhuǎn)錄本的第一個或 5' 末端 G 摻入，因為其結(jié)構(gòu)使得無法在 RNA 分子中的其他位點將其摻入。
mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒工作原理
mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒有簡化的反應(yīng)形式，其中所有 4 種核糖核苷酸和帽類似物混合于單一溶液中。該溶液的帽類似物:GTP 比值為 4:1，這適用于盡可能提高 RNA 得率和加帽轉(zhuǎn)錄本比例。mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒適用于卵母細(xì)胞顯微注射用加帽 RNA 常規(guī)合成、體外翻譯、轉(zhuǎn)染和其他應(yīng)用。在存在高核苷酸濃度的情況下，通過優(yōu)化 RNA 合成的反應(yīng)條件來實現(xiàn)高得率。此外，合成的 RNA 不會被任何可能含有 RNase 抑制劑（酶混合物的組成部分）的污染性核糖核酸酶降解。
使用 mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒
在 20 µL 反應(yīng)中，在 2 小時孵育期間，mMESSAGE mMACHINE™ 高得率加帽 RNA 轉(zhuǎn)錄將生成大量的加帽 RNA。該方法獲得的得率為使用常規(guī)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的 10–50 倍。帽類似物與 GTP 的比值已經(jīng)過優(yōu)化，能夠在得率 (15–35 µg) 與加帽轉(zhuǎn)錄本的比例 (80%) 之間實現(xiàn)良好折衷。mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒還包含一份 LiCl 沉淀溶液，該溶液可高效分離來自加帽 RNA 的蛋白和未摻入的核苷酸（包括游離帽類似物），提高翻譯效率。mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒僅針對與試劑盒中包含的聚合酶配合使用進行了優(yōu)化。使用不同的聚合酶可能會導(dǎo)致得率低。mMESSAGE mMACHINE™ 試劑盒包含 25 次轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的所有緩沖液和試劑。使用試劑盒提供的對照模板（非洲蟾蜍延伸因子 1α，pTRI Xef），每次 mMESSAGE mMACHINE™ 反應(yīng)將使用 T3 或 T7 RNA 聚合酶生成約 20–30 µg 的 RNA，或使用 SP6 RNA 聚合酶生成約 15–25 µg RNA。
Invitrogen T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒
