實驗步驟

1. 樣品準備

a. 細胞上清樣品，需將培養(yǎng)瓶內的細胞消化離心取上清即可（如800g，5分鐘）。

b. 血清樣品，將全血收集至不含抗凝劑的試管內，在室溫下放置1小時，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1500g離心10分鐘，取黃色上清即得血清。

c. 血漿樣品，將全血收集至含抗凝劑的試管內，混勻后置冰上，4℃約1500g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿。

2. 確定樣品測試組、標準品和空白組組所需的微孔條數量，每個濃度做兩個平行重復，從支架上取出對應數量的微孔條，剩余儲存在箔袋中，密封后在4℃儲存。

3. 配制對應濃度的捕獲抗體溶液、檢測抗體溶液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液、鏈霉親和素-HRP（若使用試劑盒則沒有此步驟或按試劑盒要求配制）。

4. 每孔加入100μL 捕獲抗體溶液，用封板膜覆蓋，4℃孵育過夜，過夜后舍棄舍板內溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗滌液清洗五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干（若使用試劑盒則沒有步驟4和5）。

6. 用樣品稀釋液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀釋樣品，以此確定樣品IL-2的檢測濃度。

7. 配制梯度濃度的IL-2蛋白標準品，將工作濃度設置為1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL, 18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此濃度來繪制標準曲線。

8. 分別將樣品、標準品、樣品稀釋液按照100μL/孔加入相應孔中作為標測試組、標準品組、空白組。

9. 將偶聯(lián)sws的抗人IL-2抗體按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育2小時。

10. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀釋后的鏈霉親和素-HRP，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育1小時。

12. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB顯色液。用封板膜覆蓋，室溫避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入終止液50μL，混勻后立即測量A450值。

15. 計算每一組重復的標準品和樣品的平均吸光度值。重復次數應在平均值的20%以內。

16. 繪制IL-2標準品標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應濃度。