DWD-1紫外檢測儀(高性能雙光束雙波長)內(nèi)置數(shù)據(jù)處理
波長范圍:254nm、280nm(同時檢測)、另在254nm、280nm-400nm譜線之間任選兩個波長同時檢測。
*DWD-1儀器特點
蛋白質(zhì)280nm/254nm雙波長測定:
蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的、等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì),其吸收高峰在280nm波長處,且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關系,故可作為蛋白質(zhì)定性、定量測定的依據(jù),正因為如此,280nm處的紫外吸收法通常被用于層析系統(tǒng)中蛋白質(zhì)濃度的連續(xù)監(jiān)控。但由于各種蛋白質(zhì)的和的含量不同,故要準確定量,必需要有待測蛋白質(zhì)的純品作為標準來比較,或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考。另外,不少非蛋白物質(zhì)在280nm波長下也有-定吸收能力,可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴重。在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強10倍(每克),但核酸在254nm處的吸收更強,其吸收高峰在254nm附近。核酸254nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍,
而蛋白質(zhì)則相反,280nm紫外吸收值大于254nm的吸收值。
通常:
純蛋白質(zhì)的光吸收比值:A280/A254》1.8
純核酸的光吸收比值:A280/A254《0.5
因此蛋白質(zhì)溶液中同時存在核酸時(生物體系大多數(shù)如此),必須同時測定OD254nm,與OD280nm。然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值,通過經(jīng)驗公式校正,以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實含量。
蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280-0.74×A254(mg/ml)
此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。