一、熒光素酶的基本特性
熒光素酶（Luciferase）是能夠催化底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，在自然界中廣泛存在，如螢火蟲、真菌和海洋生物等都能產生熒光素酶。其中，螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）是兩種常用的熒光素酶。
二、熒光素酶檢測的原理
熒光素酶檢測的原理基于熒光素酶催化底物氧化時產生的生物熒光。當熒光素酶存在時，它能催化熒光素（或其他底物）氧化成氧化熒光素（或其他氧化產物），并在此過程中釋放出光能，即產生熒光。通過檢測這種熒光，我們可以間接地測量熒光素酶的活性或相關生物分子的含量。
三、熒光素酶檢測的應用
?報告基因測定?：熒光素酶常作為報告基因用于檢測基因表達。通過將熒光素酶基因與待檢測基因的啟動子連接，當啟動子被轉錄時，熒光素酶基因也會被轉錄并表達，從而產生熒光。通過測量熒光強度，我們可以評估啟動子的活性或基因的表達水平。
?啟動子研究?：熒光素酶檢測可用于研究啟動子的強度和活性。通過將熒光素酶基因置于啟動子后面，并測量產生的熒光強度，我們可以判斷啟動子的強弱。
?miRNA研究?：在miRNA研究中，熒光素酶檢測可用于檢測miRNA對目標基因的調控作用。通過將目標基因的3'UTR與熒光素酶基因連接，并測量熒光強度的變化，我們可以評估m(xù)iRNA對目標基因的抑制作用。
?信號轉導通路研究?：熒光素酶檢測還可用于研究信號轉導通路中的分子相互作用和信號傳遞過程。
四、熒光素酶檢測的步驟
熒光素酶檢測通常包括以下幾個步驟：
?質粒構建?：將熒光素酶基因與待檢測基因的啟動子或3'UTR連接，構建成報告基因質粒。
?細胞轉染?：將報告基因質粒與實驗細胞共轉染。
?細胞培養(yǎng)?：在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)細胞，使熒光素酶基因得以表達。
?細胞裂解?：培養(yǎng)一定時間后，取出培養(yǎng)基并裂解細胞，釋放熒光素酶。
?熒光檢測?：向裂解物中加入熒光素酶底物，并使用熒光測定儀檢測熒光強度。
miRNA通過堿基配對結合到靶mRNA的3'UTR區(qū),抑制靶基因的翻譯或對靶基因mRNA的降解達到調控基因表達的目的。將靶mRNA的3'UTR區(qū)構建至螢火蟲熒光素酶報告基因的3'端，與miRNA表達載體及海腎熒光素酶報告基因載體并轉染細胞，先后加入兩種底物熒光素，通過對熒光素酶報告基因的表達檢測確認miRNA對靶基因的調控效果。
熒光素酶檢測技術應用：通過miRNA靶標的鑒定，從而進行miRNA功能的深入研究。
| 實驗問題 | 原因 | 推薦解決方法 |
| 發(fā)光檢測值過低 | 熒光素酶表達過低 | 注意調整細胞狀態(tài)、轉染條件、轉染量，提高發(fā)光值 |
| 檢測試劑 | 避免反復凍融以及保存時間過長 | |
| 發(fā)光檢測值過高 | 熒光素酶表達過高 | 建議通過降低轉染量或減少檢測體積等降低發(fā)光 |
